申请/专利权人：云南省林业和草原科学院;迪庆藏族自治州哈巴雪山省级自然保护区管护局

申请日：2023-03-13

公开（公告）日：2024-07-02

公开（公告）号：CN116349601B

主分类号：A01H4/00

分类号：A01H4/00;A01H1/02;A01H6/62;A01C1/02;A01G22/63

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.07.02#授权;2023.07.18#实质审查的生效;2023.06.30#公开

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法；本发明的目的是提供一种斑叶杓兰繁殖的有效途径；采用的技术方案具体包括以下步骤：1）人工授粉，2）蒴果采摘，3）低温处理，4）种子消毒，碱蚀种皮，播种，5）恒温培养；本发明通过野外人工授粉、适时采摘种子、碱蚀软化种皮及去除抑制化学物质、不同的播种培养基配方及添加物对斑叶杓兰萌发的影响试验，解决了斑叶杓兰非共生无菌萌发难题，为斑叶杓兰的人工驯化、繁殖及栽培奠定基础，以更好的保护和合理利用斑叶杓兰植物资源。

主权项：1.一种极小种群斑叶杓兰非共生无菌萌发的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）人工授粉授粉方式:异花授粉；授粉地选择：选择群落数量较多且开花植株数量较多的地块进行授粉，便于观察对比；授粉季节：7月中旬至7月底斑叶杓兰进入盛花期，是人工辅助授粉最佳时间；授粉植株及花粉块选择：选择生长健康、花朵盛开且未自然授粉的植株，已完成自然授粉的植株中萼片会盖在花瓣及柱头上；选择乳黄色带粘性的花粉块，不能使用霉变或老化的花粉块；授粉方法：选择晴天，并在上午8点至12点期间进行；用刀片取下唇瓣，用镊子取出花粉涂在柱头上，轻轻按压，完成授粉，用铅笔写好标牌，挂在授粉母株上；2）蒴果采摘采集授粉后90-110天的蒴果，蒴果变为紫红色，种皮白色和淡浅褐色时采收；3）低温处理种子活力测定：在无菌播种前需要进行种子活力测定以了解种胚的发育情况和生理活性，避免因使用无生活力的种子而造成的人力、物力和时间浪费，同一个蒴果中取出大部分种子用于播种，余下部分种子用于TTC染色；低温处理：用75%酒精擦去果面脏物，阴干；用无菌滤纸包裹，放入经高温灭菌并加入干燥剂的组培瓶内；置于4℃恒温箱内30天；4）种子消毒，碱蚀种皮，播种将低温处理且未裂开的蒴果，在无菌操作台上用75%酒精擦拭蒴果表面，等表面酒精挥发干后，用消毒刀片将蒴果剖开，取出种子置于0.1%的HgCl2浸泡消毒10分钟，消毒后用灭菌蒸馏水冲洗6-8次，再放入0.1molLKOH溶液中浸泡10分钟，腐蚀种皮,使种皮透水透气，促进种子萌发，用灭菌蒸馏水冲洗6-8次，放于垫有无菌滤纸的盘上，置于无菌操作台上晾干，用无菌药匙或接种铲将种子抖落到非共生萌发培养基中进行播种；所述非共生萌发培养基具体配方为：以改良的KnudsonC为基本培养基，添加20gL蔗糖、50gL土豆、2gL胰蛋白胨、0.2mgL6-苄氨基腺嘌呤、活性炭1gL,用氢氧化钠溶液和盐酸调节培养基pH至5.5；所述改良的KnudsonC配方为：KH2PO4125mgL；CaNO32.4H2O500mgL；NH42SO4250mgL；MgSO4•7H2O125mgL；FeSO4·7H2O12.5mgL；MnSO4·4H2O3.75mgL；5）恒温培养将播种好的培养瓶置于恒温箱进行培养，培养条件为温度：20℃，暗培养90d，萌发形成原球茎，转移到新配置的培养基，所述新配置的培养基为改良的KnudsonC配方，60天白色原球茎伸长生长形成白色或淡褐色的根状茎，进行光照培养，光照时间为12hd，光照强度为2000Lx，110天根状茎顶端分化处芽，芽高1.5～3cm,根长2～5cm时出瓶移栽。

全文数据：

权利要求：

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