申请/专利权人：东莞再立健生物科技有限公司

申请日：2023-12-20

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN117431210B

主分类号：C12N5/0783

分类号：C12N5/0783;A61K47/46;A61K45/00;A61P35/00;A61P35/04

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.28#授权;2024.02.09#实质审查的生效;2024.01.23#公开

摘要：本发明公开了一种促进NK细胞分泌外泌体的提取方法及其应用；其中，提取方法包括步骤：第0天，NK细胞接种于培养瓶中静置培养；第3至第19天，每隔几天更换一次细胞培养液，且每次收集倒出的培养废液并离心处理，独立收集每次离心获得的外泌体；第20天，停止培养，再次收集倒出的培养废液并离心处理，收集离心获得的外泌体。该外泌体提取工艺中，通过间歇性模拟体内免疫炎症反应的38℃温度，可以刺激NK细胞达到促炎作用，让NK细胞短期内提高细胞因子（如TNF‑α、IL‑1β、IL‑6）的分泌，以缩短适应新鲜培养基的时间，达到维持外泌体高浓度水平产出。

主权项：1.一种促进NK细胞分泌外泌体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：第0天，在培养瓶中加入300ml的细胞培养液，并在培养瓶中接种5×107个NK细胞；随后将NK细胞置于环境为37℃、5vv%CO2条件下的培养箱中静置培养；其中，所述细胞培养液以DMEM为基础培养基，以及在该基础培养基中添加含终浓度为1500IUml的IL-2、终浓度为30ngml的IL-15、终浓度为34ngml的SCF、终浓度为30ngml的TGF、终浓度为14ngml的PDGF及终浓度为3μMStemRegenin1；第3天至第19天，每隔3天换液一次，收集每次换液倒出的培养回收液，随后每次补加500ml细胞培养液，摇匀NK细胞后，首先在培养箱环境为38℃、5vv%CO2条件下静置培养1天，接着在培养箱环境为37℃、5vv%CO2条件下继续静置培养；第20天，停止NK细胞培养，收集培养瓶中倒出的培养回收液；其中，在第3天至第20天的NK细胞培养中，对每次收集到的培养回收液分别按照3000g、离心30min进行第一次离心处理；每次离心结束后，获得第一上清液；按照第一上清液与沉析液的体积比为2:1，往每次获得的第一上清液中加入8ww%PEG6000溶液，摇匀后于5℃下静置8h；接着分别按照13000g、离心1h进行第二次离心处理，离心结束后，去掉离心得到的第二上清液，获得相应的外泌体，分别存储于-20℃下，备用。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 东莞再立健生物科技有限公司 一种促进NK细胞分泌外泌体的提取方法与应用

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