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申请/专利权人：吉林大学;黑龙江飞鹤乳业有限公司

摘要：本发明的基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法属于乳品技术领域。步骤包括：样品采集、乳清蛋白提取和分离、过滤辅助样品制备酶解、建库样本准备、DDA建库数据采集、DIA进行生物样本定量数据采集、差异表达蛋白质筛选及功能分析等。本发明首次从不同民族的人乳差异性出发，采用DIA技术对朝鲜族和汉族母乳中的乳蛋白进行系统化、高通量的研究，并进行比较分析，鉴定出的总蛋白种类多，能全面的获得不同民族之间人乳蛋白的差异，为开发针对特定人群的创新性婴幼儿配方食品提供技术支持和新的研发思路。

主权项：1.一种基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法，有以下步骤：步骤1：样品采集采集不同民族新鲜母乳，每例30毫升放入50毫升的无菌离心管中，并贴上标签，获得的样品立即放置在-80℃的冰箱中储存，同一民族随机6~10个样品混合成一个混合样品，每个民族收集至少三个平行的混合样本进行生物学重复；步骤2：乳清蛋白提取和分离将蛋白酶抑制剂加入母乳样品，取12mL母乳样品装入15mL离心管；4℃，3000rpm，离心30min分层，最上层为脂肪层，贴挂侧管壁，轻柔倒出下层脱脂奶液至新管，留脂肪层于原离心管中；磷酸缓冲液冲洗脂肪层5次，4℃存放待用；脱脂奶液取1mL用10%乙酸调节溶液pH值至4.6，用于酪蛋白析出，4℃，10000rpm，离心15min，使乳清蛋白与酪蛋白分离；乳清蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，取上清液，加入4倍体积预冷丙酮，-20℃过夜，沉淀用预冷丙酮清洗3次，得到乳清蛋白沉淀，吹干备用；酪蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，除去上清液，沉淀即为酪蛋白，预冷丙酮清洗3次，吹干备用；脂肪蛋白提取：在母乳样品进行离心分离后得到的脂肪层中加入3倍体积甲醇，涡旋震荡，至脂肪层破碎悬浮于甲醇，4℃，9000g，离心10s；除去上清液，加入体系2倍体积的氯仿，涡旋震荡，至沉淀悬浮于氯仿；向体系中加入体系3倍体积去离子水，混匀，4℃，9000g，离心1min，溶液分三层，下层为氯仿，中间层为蛋白层，将上清液移除，向剩余体系中加入3倍体积甲醇，混匀，4℃，9000g，离心2min；除上清，将沉淀用甲醇洗涤2次，吹干，沉淀即为脂肪蛋白；步骤3：过滤辅助样品制备酶解基于过滤辅助样品制备方法，对100µg蛋白质样品进行蛋白质酶水解，所述的蛋白质样品是步骤2中分离出的乳清蛋白、酪蛋白、脂肪蛋白的一种，向蛋白质样品中添加8M尿素，使总体积达到200µL，加入二硫苏糖醇至体系中DTT最终浓度为10mM，并使混合物在56℃下静置30分钟，添加碘乙酸至碘乙酸的终浓度为50mM，并在室温下无光反应40min，将样品转移到10K超滤管中，然后在室温下以12000g离心，弃掉滤液，并重复该步骤三次，添加200µL浓度为50mM的碳酸氢铵溶液，然后在室温下以12000g离心，丢弃滤液，并重复该步骤3次，将胰蛋白酶以样品:酶=50:1的质量比添加到试管中，并在37℃下酶解16小时，通过在12000g、4℃下离心获得多肽样品，然后冷冻干燥；步骤4：建库样本准备酶解后的多肽样品在色谱仪中进行HighpH反相色谱分级，柱子在初始条件下平衡5min，柱流速维持0.4mLmin；随后柱流速增至0.7mLmin，使用1.5mlEP管，每1分钟接收1管；步骤5：DDA建库数据采集另取酶解后的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nLmin；所述溶液B为98%ACN，2%ddH2O，pH10；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：（1）MSn1:扫描范围mz:375-1500；分辨率：120,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；（2）MSn2：分辨率：15,000；AGCtarget=5e4；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30%；将获得的质谱数据用ProteomeDiscoverer2.1.0182进行蛋白质分析，最终获得DDA参考谱图库；数据处理参数为：搜库引擎采用SequestHT；蛋白质数据库用UniprotTaxId：9606；设置胰蛋白酶酶解；最大允许漏切位点设为2；肽段水平的假阳性率设置为1%；肽和片段质量误差分别设置为±10ppm和±0.02Da；步骤6：DIA进行生物样本定量数据采集另取步骤3中的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nLmin；轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：（1）MSn1:扫描范围mz:350-1500；分辨率：60,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；（2）MSn2：分辨率：30,000；AGCtarget=3e5；最大注入时间：54ms；碰撞能量：33%；用Skyline软件进行DIA分析，通过导入步骤5所得的DDA参考谱图库，对DIA原始数据进行多肽信号提取与定量分析，设置参数为：多肽长度选6-25；子离子mz要求为大于母离子且lastion-3；子离子最大数目设为5；子离子最小数目设为2；子离子抽提窗口采用5min；Dotp需要大于等于0.6；步骤7：差异表达蛋白质筛选将符合FC1.5或0.67，且Pvalue0.05的蛋白设定为差异表达蛋白，并进行GO和KEGG功能富集分析和蛋白互作分析。

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