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申请/专利权人：湖南大学

摘要：本发明公开了一种用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法，包括有：球形核酸报告子、RCA产物和CRISPRCas12a体系；其中：球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子；RCA产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物；CRISPRCas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物。本发明SNA在生理环境中具有优异的抵抗核酸酶切割的能力。因此，用SNA报告子代替ssDNA报告子可以提高CRISPRCas12a体系的稳定性；并利用滚环扩增RCA具有操作简单、反应温度温和、扩增效率高等优点，将RCA与CRISPRCas12a体系结合在一起，在可以显著提高体系的灵敏度。

主权项：1.一种检测ctDNA的生物传感检测系统，其特征在于，包括有：球形核酸报告子、RCA产物和CRISPRCas12a体系；其中：球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子；RCA产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物；CRISPRCas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物；LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物与RCA产物、球形核酸报告子的体积比为1:5:5；5’磷酸化线性挂锁探针序列如序列1所示，具体为：AAATCACTGAGTTTATCATGTATTATAATTTCGTATGTAAGCTACCTGAGATCTTCTGTACAATTGATCCTCTCTCTA；crRNA的序列如序列2所示，具体为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUAUGUAAGCUACCUGAG；所述RCA产物的制备包括：将5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CAE542KM和T4连接酶混合在1×T4连接酶反应缓冲液中，进行第一次孵育，然后通过热处理灭活T4连接酶，最终获得环状DNA模板；扩增反应中，向上述反应液中加入dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液，进行第二次孵育，同样通过热处理灭活phi29酶，最终得到RCA产物；所述金纳米粒子的制备方法包括：在干净的圆底烧瓶中加入氯金酸溶液，放入油浴锅中，溶液沸腾设定时间后加入柠檬酸钠溶液，提高转速，溶液颜色变成酒红色后，再继续煮沸，然后待其自然冷却到室温后，得到含金纳米粒子的分散液，低温避光保存；所述球形核酸报告子的制备包括：用TCEP活化处理FAM荧光基团修饰的巯基DNA链，将处理后的巯基DNA链与所述金纳米粒子分散液按照设定的比例混合，再加入吐温20和Citrate-HCl，37℃放置过夜；然后向溶液中加入NaCl，放置过夜；最后用无酶水洗3次，洗掉多余的ssDNA，得到球形核酸报告子；所述处理后巯基DNA链与金纳米粒子的摩尔比490~510:1；所述稳定二元复合物的制备包括：将LbCas12a蛋白和crRNA在1×NEB缓冲液中孵育，得到稳定的LbCas12acrRNA二元复合物；所述LbCas12a蛋白和crRNA的比例为1nM:10nM。

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