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申请/专利权人：江苏亢钧生物科技有限公司

摘要：本发明旨涉及一种利用高效液相色谱制备眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30标准品的方法，其特征在于，本发明采用反相高效液相色谱法，通过不断优化制备条件，最终以ZorbaxSB300‑C8色谱柱（9.4mm*250mm，5μm），流动相A为0.05%水溶液TFA，流动相B为0.05%TFA的乙腈溶液，先进行洗脱，测得眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30产物占粗样品蛋白含量的百分比，再对粗样品进行分离纯化，制备眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30标准品，分离纯化洗脱梯度条件为0‑12min，线性A:B梯度比例98:2‑76:24；12‑160min，线性A:B梯度比例76:24‑60:40；160‑165min，线性A:B梯度比例60:40‑40:60；165‑170min，A:B梯度比例40:60。最终制得的眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30标准品纯度达到95%，为眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30基因工程表达后续研究提供了基础。

主权项：1.一种利用高效液相色谱制备眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30标准品的方法，其特征在于所述制备步骤如下：S01：眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30上清液的制备；S02：眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30上清液的透析；S03：利用反相高效液相色谱对所述S02的眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30上清液进行洗脱，测得眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30产物占粗样品蛋白含量的百分比；具体洗脱色谱条件为：色谱柱为ZorbaxSB300-C8，9.4mm×250mm，粒径5μm；流速0.3mLmin；柱温条件为室温25℃；上样量4ml；洗脱液A为0.05%水溶液TFA，pH2.0；洗脱液B为含0.05%TFA的乙腈溶液；具体洗脱梯度为0-10min，20%洗脱液B；10-40min，50%洗脱液B；40-50min，20%洗脱液B；S04：利用反相高效液相色谱对眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30粗样品进行分离纯化，制备眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30标准品；具体分离纯化色谱条件为：色谱柱为ZorbaxSB300-C8，9.4mm×250mm，粒径5μm；流速0.3mLmin；柱温条件为室温25℃；上样量4ml；洗脱液A为0.05%水溶液TFA，pH2.0；洗脱液B为含0.05%TFA的乙腈溶液；具体洗脱梯度为0-12min，线性A:B梯度比例98:2-76:24；12-160min，线性A:B梯度比例76:24-60:40；160-165min，线性A:B梯度比例60:40-40:60；165-170min，A:B梯度比例40:60。

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