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申请/专利权人：苏州大学

摘要：本发明涉及生物技术领域，尤其涉及丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用。本发明选用外泌体来传递ncRNA，进一步采用丝素蛋白水凝胶来包裹外泌体。实验表明，经包裹的外泌体能够缓慢和稳定的释放到细胞外基质中，提高了外泌体的滞留时间，并能够将过表达的ncRNA转运到细胞内。

主权项：1.过表达ncRNA的间充质干细胞的外泌体制备促进鼠后肢缺血组织血流恢复的制剂中的应用，其中，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；所述过表达ncRNA的间充质干细胞的外泌体由miRNAmimics转染间充质干细胞后，经培养制得；所述培养采用去除外泌体的含有10%胎牛血清的α-MEM培养基；所述培养后，收集上清液经分离获得过表达ncRNA的外泌体。

全文数据：丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用技术领域本发明涉及生物技术领域，尤其涉及丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用。背景技术衰老和很多人类疾病相关，如心血管疾病，神经退行性疾病，癌症和代谢功能障碍等疾病。由于全世界有大量人口经受着这些疾病，同时衰老相关表型造成老年人异常虚弱，因此很多人对了解衰老的原因以及如何预防衰老过程有着浓厚的兴趣。比如在心脏衰老的过程中，活性氧和TGF-β信号途径增加，基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂之间的失衡以及线粒体中积累的DNA突变，这将会导致心血管平衡发生变化，随后增加心肌细胞体积，降低心肌细胞数量，增加心肌胞外基质沉积特别是胶原蛋白，最后导致左心室肥厚，纤维化和心脏舒张功能障碍。因此如何延缓个体器官衰老成为全人类迫在眉睫的任务。目前涉及延缓衰老的相关治疗方法，例如，中药，运动和热量限制均通过减少产生有害的代谢副产物和激活“长寿途径”从而延长寿命。研究还发现，心脏祖细胞、心脏干细胞、胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞来源的外泌体对心肌梗死后心脏发挥有益作用。此外非编码RNAncRNA在心肌梗死和心脏衰老中发挥转录翻译后调控作用，特别是长度约22个核苷酸的微小RNAmiRNA。一些异常表达的miRNA在心脏生理和衰老中发挥作用。例如，miR-34a在衰老的小鼠心脏和人类心脏中表达上调，沉默miR-34a会减少心肌细胞的凋亡，其机制是miR-34a通过靶定PNUTS影响DNA损伤反应途径从而减少端粒缩短和DNA损伤,下调miR-34a能明显延缓小鼠衰老状况。总之，对miRNA的研究表明，miRNA具有作为诊断衰老的标记物或治疗靶点的潜力。而心脏和后肢衰老过程中miRNA如miRNA-675均下调，并通过预测和实验验证该miRNA参与抑制衰老相关的的下游靶基因和分子通路。因此我们提出使用该miRNAmimics进行预防和延缓衰老。因为miRNA是短链核苷酸序列，因此通过miRNA对个体治疗无个体间差异，能避免外来分子造成的免疫原性。miRNA治疗是近年发展起来的一项新型临床前沿技术，其原理是通过将miRNA移植到接近衰老的组织或者缺血的后肢组织，从而下调衰老相关的蛋白，延缓后肢的衰老进程，进而促进血流恢复，后肢耐力等。裸露的miRNA容易受到血液组织液或细胞外基质内RNase的降解，因此提高miRNA运输到靶细胞的效率能进一步miRNA的治疗效果。目前常用的方法是采用miRNA分子进行治疗需要将miRNA分子与细胞外基质的酶隔离开来，以保证miRNA能稳定的运输到靶细胞内。目前常用的方法是将miRNA分子进行修饰如锁核苷酸修饰以及使用慢病毒过表达载体，纳米物质或水凝胶过表达miRNA载体或成熟的miRNA将其运输到靶定组织中。尽管最新研究表明，miRNA的锁核苷酸修饰和慢病毒过表达载体在传递miRNA时效果良好，但是锁核苷酸修饰对分子效果和后续的降解的影响未可知，而尽管慢病毒是在HIV-1人类免疫缺陷I型病毒病毒基础上改造而成的自身失活性的病毒载体系统，但是在大众的认知里直接注射慢病毒载体相对难以接受。因此使用对心脏有益的外泌体来递送miRNA，一方面避免了其与细胞外环境接触，另一方面，外泌体能和细胞膜融合或者被细胞内吞从而直接将miRNA递送到细胞内。由于衰老是一个自然而缓慢的过程，而使用外泌体传递miRNA的半衰期较短，而如何提高外泌体在组织中的滞留时间仍是研究的难点。为了模拟个体衰老过程中发生的细胞凋亡，增殖降低，炎症增加，身体机能下降等，我们拟采用小鼠后肢急性缺血模型来部分模拟组织的自然衰老。发明内容有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供过表达ncRNA的外泌体及其制备方法与在制备促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂中的应用，该外泌体具有良好的促进缺血组织血流恢复和或改善血流的效果，制成制剂具有良好的缓释效果。本发明提供的过表达ncRNA的外泌体，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明采用的ncRNA是一种miRNA，其是由长非编码RNA-lncRNAH19编码产生的，由22个核苷酸组成，命名为ncRNA-miR-675。本发明提供的过表达ncRNA的外泌体的制备方法为，由miRNAmimics转染间充质干细胞后，经培养制得；所述ncRNA的序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明中，所述培养采用去除外泌体的含有10％胎牛血清的α-MEM培养基。本发明中，所述培养后，收集上清液经分离获得过表达miRNA的外泌体。本发明提供的外泌体在制备促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂中的应用。本发明还提供了一种促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂，包括由丝素蛋白和本发明提供的外泌体制得的凝胶。本发明所述丝素蛋白与外泌体的质量比为20:0.55。本发明提供的促进缺血组织血流恢复和抗衰老制剂的制备方法为：将丝素蛋白水溶液经3次30％强度的超声，每次超声30s，然后与所述外泌体混合，35℃～40℃放置5min～10min，制成凝胶制剂。本发明实施例中，所述丝素蛋白水溶液的浓度为0.04gmL。本发明实施例中，所述丝素蛋白水溶液的体积与外泌体的质量比为0.5mL：0.55mg。本发明选用外泌体来传递ncRNA，进一步采用丝素蛋白水凝胶来包裹外泌体。外泌体的天然膜结构能够起到隔绝ncRNA和细胞外基质的作用，外泌体通过和靶细胞融合或被靶细胞内吞而将其中的内含物释放到细胞内，这样外泌体中的内含物可以在不接触细胞外基质的情况下传递到靶细胞内。丝素蛋白作为一种天然的蛋白，提取方便，无免疫原性，且无需交联剂即可成胶，丝素蛋白水凝胶可以作为细胞支架，将细胞稳定的包封丝素蛋白水凝胶中，且基本不影响细胞的存活和状态。实验表明，经包裹的外泌体能够缓慢和稳定的释放到细胞外基质中，提高了外泌体的滞留时间，并能将ncRNA稳定的运送到细胞内。附图说明图1示丝素水凝胶包裹的过表达miR-675的UMSC外泌体的制备方法；图2示外泌体的流式细胞仪鉴定结果；图3示过表达miR-675的UMSC外泌体的miR-675的对应表达量；图4示去除丝胶前后的蚕丝的自发荧光；图5示超声后的丝素蛋白水溶液成胶后的不流动性，吸光度增加和可注射性；图6示小鼠左后肢肌肉中过表达miR-675的外泌体的荧光信号；图7示各组小鼠不同的时间点检测后肢血流恢复情况；图8示缺血后1个月检测不同处理组小鼠的跑步距离。具体实施方式本发明提供了过表达ncRNA的外泌体及其制备方法与在制备促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的过表达ncRNA的外泌体，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明使用的ncRNA-miR-675是由长非编码RNA-lncRNAH19编码产生的，其由22个核苷酸组成，序列为5'-UGGUGCGGAAAGGGCCCACAGU-3'，随着多种组织后器官中的衰老的进程的发展，miRNA的表达下调，而且已有研究表明该miRNA能通过靶定USP10来抑制衰老相关蛋白P53和P21的表达。实验表明，该miRNA能下调衰老相关蛋白P21和TGF-β1的表达。本发明选用外泌体来传递miRNA，外泌体是近几年研究比较多的一种细胞分泌的细胞外囊泡，大小约为40～100nm，其主要是通过其表面蛋白和所过表达的物质发挥细胞间信息交流的作用。外泌体的天然膜结构能够起到隔绝miRNA和细胞外基质的作用，外泌体通过和靶细胞融合或被靶细胞内吞而将其中的内含物释放到细胞内，这样外泌体中的内含物可以在不接触细胞外基质的情况下传递到靶细胞内。本发明使用脐带间充质干细胞的外泌体来传递miRNA。本发明提供的过表达ncRNA的外泌体的制备方法为，由miRNAmimics转染间充质干细胞后，经培养后从培养基上清制得；所述ncRNA的序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明中，所述转染采用lipofectamin2000。所述脐带间充质干细胞为6～10代未分化的UMSC。所述转染的时间为6h。本发明中，所述培养采用去除外泌体的含有10％胎牛血清的α-MEM培养基。所述培养的时间为48h。本发明中，所述培养后，收集上清液经分离获得过表达miRNA的外泌体。分离外泌体的方法具体为：4℃，将上清液2000g离心30min，弃沉淀然后加入12体积的总外泌体分离试剂Invitrogen；混匀后4℃静置12h，4℃10000g离心60min，白色沉淀即为包裹miRNAmimics的UMSC外泌体，取沉淀以PBS重悬后保存。本发明提供的外泌体在制备促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂中的应用。实验表明，本发明提供的外泌体能够恢复缺血小鼠的血流，提高跑步距离，因此具有促进缺血组织的血流恢复和促进组织损伤修复的作用。本发明提供的外泌体在制备抗衰老的制剂中的应用。本发明还提供了一种促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂，包括由丝素蛋白和本发明提供的外泌体制得的凝胶。本发明所述丝素蛋白与外泌体的质量比为20:0.55。所述丝素蛋白为提取自家蚕蚕茧的蛋白，其提取方法包括：1、将家蚕蚕茧剪成1cm2大小，取5g加入到煮沸的2升0.02MNa2CO3水溶液中，保持煮沸30min，期间不断搅拌，促进丝蛋白的分散和丝胶蛋白的溶解；2、取出丝素在超纯水中冷却，并搅拌洗去丝素蛋白上结合的丝胶蛋白，随后将剩余的蚕丝主要为丝素蛋白放置于超净工作台中晾干。因丝胶蛋白自发荧光强，并于荧光显微镜下观察去除丝胶前后的蚕丝的自发荧光图4，来检测丝胶蛋白去除是否完全；3、称取一定量的蚕丝蛋白，并向其中加入一定量的9.3M溴化锂溶液以保证最终的丝素蛋白溶液达到0.2gmL浓度，将加入溴化锂的丝素在60℃的烤箱中溶化4h进行溶解，丝素完全溶解后呈透明的琥珀色；4、随后将溶解的丝素蛋白加入到分子截留量为3kDa的透析袋中，使用超纯水透析48h，之后使用9000rpm在4℃离心20min除去沉淀；5、离心后上清蛋白即为丝素蛋白水溶液，通过部分烘干计算其浓度。通过PEG10000进行浓缩或者加入ddH2O进行稀释将蛋白浓度调整到0.04gmL，获得丝素蛋白水溶液，之后将该丝素蛋白4℃保存备用。本发明提供的抗衰老制剂的制备方法为：将丝素蛋白水溶液经3次超声，每次超声强度均为30％，超声30s，然后与所述外泌体混合，35℃～40℃放置5min～10min，制成凝胶制剂。本发明实施例中，所述丝素蛋白水溶液的浓度为0.04gmL。本发明实施例中，所述丝素蛋白水溶液的体积与外泌体的质量比为0.5mL：0.55mg。本发明选用外泌体来传递ncRNA，进一步采用丝素蛋白水凝胶来包裹外泌体。外泌体的天然膜结构能够起到隔绝ncRNA和细胞外基质的作用，外泌体通过和靶细胞融合或被靶细胞内吞而将其中的内含物释放到细胞内，这样外泌体中的内含物可以在不接触细胞外基质的情况下传递到靶细胞内。丝素蛋白作为一种天然的蛋白，提取方便，无免疫原性，且无需交联剂即可成胶，丝素蛋白水凝胶可以作为细胞支架，将细胞稳定的包封丝素蛋白水凝胶中，且基本不影响细胞的存活和状态。实验表明，经包裹的外泌体能够缓慢和稳定的释放到细胞外基质中，提高了外泌体的滞留时间，同时能将ncRNA稳定的转运到细胞内。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1过表达miR-675序列为5'-UGGUGCGGAAAGGGCCCACAGU-3'UMSC外泌体的获得：1使用lipfectamine2000将miR-675mimics转染到6-10代未分化的UMSC中；2转染6h后使用含有10％去除外泌体胎牛血清的а-MEM培养基进行培养48h，收集上清；3随后将上清在2000g下4℃离心30min，弃掉沉淀，在上清中加入12体积的总外泌体分离试剂Invitrogen；4混匀后4度静置12h后在10000g下4℃离心60min，管壁上的白色沉淀即为包裹miR-675mimics的UMSC外泌体，弃去上清后用PBS重悬，获得包裹miR-675mimics的UMSC外泌体，随后4℃或-80℃保存。实施例2过表达miR-675的UMSC外泌体的鉴定1取10μgUMSC外泌体于1.5mL离心管中，加入10μL乳胶免疫微球，室温孵育15min。随后补加PBS到1mL，继续室温孵育2h，间断混匀。2加入110μL的1M甘氨酸，轻柔混匀，室温孵育10min。室温离心4000rpm离心3min，弃去上清。3使用1mL0.5％BSAPBS重悬沉淀，室温离心4000rpm离心3min，弃去上清。再用0.5mL的0.5％BSAPBS重悬沉淀。4随后向其中加入10μL的CD63-PE抗体，4度避光孵育30min。5200μL的0.5％BSAPBS洗涤2次后再使用200μL的0.5％BSAPBS重悬6孵育30min后，PBS洗两遍，流式细胞仪检测，检测结果如图2，横坐标表示荧光强度，纵坐标表示流式细胞仪检测的外泌体数目。实施例3过表达miR-675的UMSC外泌体的检测：1提取过表达miR-675的UMSC外泌体和对照组外泌体的总RNA2使用miR-675和U6特异的反转引物分别对总RNA进行反转，获得cDNA3使用SYBR定量和miR-675和U6定量引物分别对对应的cDNA进行扩增，定量PCR仪收集荧光信号，并计算过表达miR-675的UMSC外泌体的miR-675的对应表达量，检测结果如图3。实施例4丝素蛋白水凝胶的制备1将家蚕蚕茧简称1cm2大小，取5g加入到煮沸的2升0.02MNa2CO3水溶液中，并保持煮沸30min，期间不断搅拌，促进丝蛋白的分散和丝胶蛋白的溶解。2随后取出丝素在超纯水中冷却，并搅拌洗去丝素蛋白上结合的丝胶蛋白。随后将剩余的蚕丝主要为丝素蛋白放置于超净工作台中晾干。因丝胶蛋白自发荧光强，并于荧光显微镜下观察去除丝胶前后的蚕丝的自发荧光图4，来检测丝胶蛋白去除是否完全。3称取一定量的蚕丝蛋白，并向其中加入一定量的9.3M溴化锂溶液以保证最终的丝素蛋白溶液达到0.2gmL浓度，将加入溴化锂的丝素在60℃的烤箱中溶化4h进行溶解，丝素完全溶解后呈透明的琥珀色。4随后将溶解的丝素蛋白加入到分子截留量为3kDa的透析袋中，使用超纯水透析48h，之后使用9000rpm在4℃离心20min除去沉淀。5离心后上清蛋白即为丝素蛋白水溶液，通过部分烘干计算其浓度。通过PEG10000进行浓缩或者加入ddH2O进行稀释将蛋白浓度调整到4％wv％，获得丝素蛋白水溶液，之后将该丝素蛋白4℃保存备用。60.5mL4％的丝素蛋白水溶液使用30％的超声强度超声30sx3超声Branson,S150D，随后放到37℃培养箱中，成胶时间约为60min。而包封外泌体丝素水凝胶的制备是在0.5mL的0.04gmL丝素溶液中超声后加入50μL的浓度为11mgmL的外泌体溶液。随后放到37℃培养箱中，成胶时间约为5-10min。通过将丝素蛋白水溶液和超声后的丝素蛋白水溶液分别置于1.5mL离心管，96孔板和注射器中，观察在37℃培养箱中超声后的丝素蛋白水溶液成胶后的不流动性，吸光度增加和可注射性，如图5。实施例5丝素水凝胶包裹的PKH26标记的UMSC外泌体在后肢缺血的肌肉中的滞留检测1通过结扎和切除小鼠后肢股动脉和其分支获得小鼠左后肢缺血模型。2将PKH26标记的UMSC外泌体和丝素水凝胶包裹的PKH26标记的UMSC外泌体分别在缺血后注射到左后肢腓肠肌中。3在2周后取出左后肢肌肉，固定包埋切片观察外泌体的荧光信号，结果如图6。在注射未包裹的PKH26标记的外泌体组，两周后基本检测不到信号，而在丝素水凝胶包裹的PKH26标记的UMSC外泌体组，两周后仍有清晰可见的荧光信号。实施例6.丝素水凝胶包裹的过表达miR-675的UMSC外泌体在后肢缺血模型中的血流恢复情况1通过结扎和切除小鼠后肢股动脉和其分支获得小鼠左后肢缺血模型。2分别注射PBS，过表达miR-675的UMSC外泌体和丝素水凝胶包裹的过表达miR-675的UMSC外泌体。3分别在不同的时间点检测后肢血流恢复情况，结果如图7表明：各组小鼠缺血后21d的丝素水凝胶包裹的过表达miR-675的UMSC外泌体的血流恢复率为:PBS组：35.66±14.65％，N＝3过表达miR-675的UMSC外泌体组：86.40±9.08％，N＝3丝素水凝胶包裹的过表达miR-675的UMSC外泌体组：99.23±1.22％，N＝3。且如图7所示，随着时间的增加，丝素水凝胶包裹的过表达miR-675的UMSC外泌体组对后肢血流恢复的情况越好，且经包被的外泌体的效果显著优于未经包被的外泌体的效果，p苏州大学丝素水凝胶包裹的过表达ncRNA的MSC外泌体制备方法与在抗后肢衰老中的应用MP18019381SIPOSequenceListing1.0122RNA人工序列ArtificialSequence1uggugcggaaagggcccacagu22

权利要求：1.过表达ncRNA的外泌体，其特征在于，所述ncRNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。2.权利要求1所述过表达ncRNA的外泌体的制备方法，其特征在于，由miRNAmimics转染间充质干细胞后，经培养制得；所述ncRNA的序列如SEQIDNO:1所示；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。3.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述培养采用去除外泌体的含有10％胎牛血清的α-MEM培养基。4.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述培养后，收集上清液经分离获得过表达miRNA的外泌体。5.权利要求1所述的外泌体或权利要求2～4任一项所述制备方法制备的外泌体在制备促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂中的应用。6.一种促进缺血组织血流恢复和或抗衰老的制剂，其特征在于，包括由丝素蛋白和过表达miRNA的外泌体制得的凝胶；所述过表达ncRNA的外泌体为权利要求1所述的外泌体或权利要求2～4任一项所述制备方法制备的外泌体。7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述丝素蛋白与外泌体的质量比为20:0.55。8.权利要求6或7所述制剂的制备方法，其特征在于，将丝素蛋白水溶液经3次30％强度的超声，每次超声30s，然后与权利要求1所述的外泌体或权利要求2～4任一项所述制备方法制备的外泌体混合，35℃～40℃放置5min～10min，制成凝胶制剂。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白水溶液的浓度为0.04gmL。10.根据权利要求8或9所述制剂的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白水溶液的体积与外泌体的质量比为0.5mL：0.55mg。

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