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申请/专利权人：广东海洋大学

摘要：本发明属于食品防腐技术领域，公开了一种通过构建Sch9基因突变株抑制镰孢菌生长的方法，本发明通过分子生物学的方法，构建基因敲除株△FoSch9和基因回补株△FoSch9‑C，向野生株、以及构建的基因敲除株△FoSch9和基因回补株△FoSch9‑C中添加不同种类的氨基酸，发现一些特定种类的氨基酸可以显著抑制尖孢镰孢菌的生长，如此可以通提前构建基因敲除株△FoSch9和基因回补株△FoSch9‑C，并通过添加一些特定种类的氨基酸，从而显著抑制尖孢镰孢菌的生长，并用于未来食品的防腐保鲜。

主权项：1.一种通过构建Sch9基因突变株抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株△FoSch9和尖孢镰孢菌基因回补株△FoSch9-C；S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、尖孢镰孢菌基因敲除株△FoSch9和尖孢镰孢菌基因回补株△FoSch9-C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L-Arg、L-Asp、L-Glu、L-Cys、L-Met或L-Tyr中的一种；所述尖孢镰孢菌基因敲除株△FoSch9的构建方法包括以下步骤：1、设计扩增Sch9基因左右同源臂的引物Sch9-A1、Sch9-A2、Sch9-A3和Sch9-A4，以尖孢镰孢菌野生株DNA为模板，分别PCR扩增Sch9基因的左右同源臂；2、纯化的左右同源臂PCR产物经过酶切后，分别连接到基因敲除载体pBluescriptKS+-pBS-HPH1的潮霉素抗性基因的前、后的多克隆位点上，得到重组的基因敲除载体pPBS-HPH-Sch9-5’3’；3、以重组载体pPBS-HPH-Sch9-5’3’为模板，用引物Sch9-A1和Sch9-A4扩增得到敲除大片段HPH-Sch9-5’3’；4、通过原生质体转化，将Sch9的敲除结构转化尖孢镰孢菌野生株的原生质体细胞，转化后原生质体通过潮霉素HYG平板筛选，25℃条件下培养至转化子长出；所述尖孢镰孢菌基因回补株△FoSch9-C是将回补载体pCA-FoSch9-C转入农杆菌AgrobacteriumtumefaciensC58C1感受态细胞中，再通过农杆菌介导的转化法将其转入Sch9基因敲除的尖孢镰孢菌基因敲除株△FoSch9中得到的，所述尖孢镰孢菌基因回补株△FoSch9-C的构建方法包括以下步骤：1、以连接Sch9基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物sch9-infu-5F和sch9-infu-3R扩增Sch9基因，PCR产物经过纯化后，利用HDCloningKit连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上，得到回补载体pCA-FoSch9-C并测序进行验证，所述sch9-infu-5F和sch9-infu-3R的序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示；2、基因回补载体向农杆菌的转化：通过向农杆菌中加入1μg质粒DNA，进行涂布平板培养后挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定；3、将农杆菌溶液与真菌孢子按比例混匀，涂布于IM平板上的硝酸纤维素膜上，放置在25℃条件下培养3d；4、将农杆菌和真菌孢子共培养物转移到真菌筛选培养基上，黑暗条件下30℃培养3d，直至菌落出现，再转接并进行单孢培养；5、培养的菌落提取待验证菌株的基因组DNA，以引物NEO-F和NEO-R进行PCR扩增，并进行测序验证；引物NEO-F和NEO-R序列分别如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示；所述抑制尖孢镰孢菌生长是指抑制菌落生长；所述尖孢镰孢菌野生株的保藏编号为GDMCCNo：60824，分类学名称为FusariumoxysporumFo17，保藏日期为2019年10月23日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。

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