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申请/专利权人：内蒙古农业大学

摘要：本发明公开了一种发根农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根一步转化方法，包括如下步骤：S1.将含有e‑GFP表达载体的质粒电转化进发根农杆菌K599感受态细胞中；S2.制备OD600nm为0.8～0.95的发根农杆菌菌悬液，并加入乙酰丁香酮；S3.培养侵染所用的细菌膏；S4.选取中间锦鸡儿幼苗，斜切幼苗子叶节下1cm处，弃去下部分，将切口进行侵染，然后将幼苗移栽回土中，给幼苗浇14B5培养基后，置于光照培养箱中进行培养。本发明通过一步法转化中间锦鸡儿毛状根使基因在毛状根中过量表达，相比于组培方法转化中间锦鸡儿毛状根，这种方法操作更加简单，不需要制备无菌苗，检测时间更短，基因表达水平高且检测方便。

主权项：1.一种发根农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根一步转化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将含有e-GFP表达载体的质粒电转化进发根农杆菌K599感受态细胞中；S2.将步骤S1中得到的发根农杆菌K599接种到LB液体培养基中培养，制备OD600nm为0.9，的发根农杆菌菌悬液，并在制备得到的发根农杆菌菌悬液中加入终浓度为50μmolmL的乙酰丁香酮；S3.取部分步骤S2中加入乙酰丁香酮后的发根农杆菌菌悬液进行离心后，去掉上清液，将剩下的沉淀混匀，然后吸取50μl混匀的沉淀加入到LB固体培养基中进行涂布，涂布后放入培养箱中培养侵染所用的细菌膏，上述操作均在超净工作台室温条件下进行；S4.选取中间锦鸡儿幼苗，斜切中间锦鸡儿幼苗子叶节下1cm处，弃去下部分，在暗环境下将中间锦鸡儿幼苗子叶节切口处浸泡在步骤S2中加入乙酰丁香酮后的发根农杆菌菌悬液中后，再将中间锦鸡儿幼苗子叶节切口刮取步骤S3中培养得到的细菌膏，刮取细菌膏后直接将中间锦鸡儿幼苗移栽回土中，给中间锦鸡儿幼苗浇14B5培养基后，将中间锦鸡儿幼苗置于光照培养箱中进行培养，12～20d后打开中间锦鸡儿幼苗所在的育苗盘的通风口，步骤S4中所述中间锦鸡儿幼苗子叶节切口处浸泡的时间为1min，所述细菌膏在所述切口切面处的厚度为0.1～0.5mm；其中，所述14B5培养基的用量为5mL；所述步骤S2的具体步骤如下：将步骤S1中得到的发根农杆菌K599接种到LB液体培养基，在28℃下，振荡培养至OD600nm为0.9得到初菌悬液，然后将初菌悬液再次转接到新鲜的LB液体培养基中，在28℃下，将初菌悬液振荡培养至OD600nm为0.8～0.95后，得到发根农杆菌菌悬液，在得到的发根农杆菌菌悬液中加入乙酰丁香酮并静置；所述初菌悬液与新鲜的LB液体培养基的体积比为1:100。

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