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申请/专利权人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司

摘要：本发明涉及重组II型变应原Derp2和Derf2蛋白的产业化生产方法，通过发酵参数优化，采用特定的培养和发酵控制条件，相比未优化的发酵条件，发酵产物活性提高50％，产量提高20％以上，并且所用的发酵培养基成分简单、成本低廉，降低了发酵工艺的成本；通过对纯化工艺的优化，收率提高了30％。并且宿主残留蛋白和残留DNA已完全满足药用级要求，表示本发明的重组II型变应原Derp2和Derf2蛋白及其制备方法已具有产业化应用前景。

主权项：1.重组尘螨II型变应原DP2和DF2蛋白的制备方法，包括发酵工艺和纯化工艺，发酵过程包括重组酵母菌株活化、种子液培养、高密度发酵，其特征在于，所用发酵培养基为60%BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：20~22℃，pH值为6.0±0.2，所述BSM培养基的组分及含量为K2SO418.2gL，MgSO414.9gL，KOH4.13gL，CaSO40.93gL，H3PO426.7mLL，甘油40gL。

全文数据：重组尘螨II型变应原Derp2和Derf2蛋白的制备与应用技术领域本发明属于生物工程基因领域，涉及重组II型变应原Derp2和Derf2蛋白的制备方法及其应用。背景技术尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具有较强的变应原性，据统计全球约10％的人口尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起。目前，临床上主要采用尘螨变应原粗提液治疗尘螨引起的变态反应性疾病，例如2006年上市的浙江我武生物的“畅迪”粉尘螨滴剂即为粉尘螨代谢培养物的提取液。尘螨变应原主要存在于排泄物和螨体中，采用提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高；此外天然变应原提取液的组成非常复杂，恒定其组分非常困难，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。长期使用尘螨变应原粗提液易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗提取液。重组变应原与粗提液相比具有以下优势：1重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；2重组蛋白成分单一，具有较好的特异性，而粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差；3重组变应原与天然提取液相比减少IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中I型和II型变应原是最主要的变应原组分。在尘螨过敏患者血清中，70-80％的患者的IgE结合Derp2户尘螨II型变应原，以下简写为DP2和Derf2粉尘螨II型变应原，以下简写为DF2，并呈现强阳性反应。DP2和DF2前体均由146个氨基酸组成，经过去除信号肽加工处理后为129个氨基酸，分子量约为14KD，无糖基化位点。目前利用真核表达系统进行DP2重组表达的研究比较具有代表性的是Stallergenes公司2011年的专利欧洲专利号：EP2388268A1，他们利用毕赤酵母表达系统对DP2进行了重组表达和纯化，该专利未针对毕赤酵母系统对DP2基因和分子构建进行优化，产量较低，纯化工艺复杂，收率低，难以满足临床给药的用量。针对DF2重组表达比较具有代表性的是胡友莹等2011年在原核表达系统中进行的研究，以及2012年崔玉宝等申请的“一种生产重组粉尘螨变应原Derf1和Derf2融合蛋白的方法”中国专利号：CN102676568A，但原核表达系统无翻译后修饰的功能，得到的DF2蛋白结构不正确，与血清反应性较弱，且后期分离纯化困难。综合以上研究结果，截止目前为止，针对DP2和DF2发酵和纯化的研究较少，且收率，结构，质量等均难以达到临床使用要求；本发明通过对DP2和DF2蛋白的发酵工艺和纯化工艺进行优化，使得发酵水平、纯化收率和质量要求均达到了重组脱敏药物临床使用要求。发明内容本申请根据本公司专利申请号201611267033.8DP2和201611267247.5DF2中提供的方法筛选到的基因工程菌株，对DP2和DF2蛋白发酵和纯化工艺中的关键质量参数进行了优化；由于DP2和DF2基因序列同源性大于90％，因此蛋白的结构和性质有较大的相似性，发明人在研究中发现DP2和DF2蛋白在纯化工艺中也有极高的相似性。本发明提供的重组尘螨II型变应原DP2和DF2蛋白的制备方法，包括发酵工艺和纯化工艺，发酵过程包括重组酵母菌株活化、种子液培养、高密度发酵，所用发酵培养基为40～60％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：20～25℃，pH值为6.0-6.5。作为优选，所用发酵培养基为60％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：20～22℃，pH值为6.0±0.2。更优选，高密度发酵的诱导阶段甲醇流加速度为30mLh-1L-1，并维持DO不高于40％。更优选，高密度发酵的限速生长阶段开始以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，后补料速度上调为60mlh-1L-1。作为优选，重组尘螨II型变应原蛋白的制备方法的纯化工艺为三步纯化，包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析。作为优选，阳离子交换层析的纯化填料为SPFF；优选的pH范围4.0-6.0。更优选的，样品和缓冲液pH为6.0。作为优选，阴离子交换层析的纯化填料为QFF；优选的pH范围6.0-9.0；优选的电导值2.0mScm-20.0mScm。更优选的，样品和缓冲液pH7.5，电导10.0mScm。作为优选，疏水层析的纯化填料为phenylFF；优选的pH范围6.0-8.0；优选的硫酸铵浓度为1.0-2.0M。更优选的，样品和平衡缓冲液硫酸铵浓度1.0M，pH6.0。本发明采用以上技术方案后，具有以下优点：通过发酵参数优化，制备的发酵液活性更高、产量更高，所采用的发酵培养基成分简单、成本低廉，降低了发酵工艺的成本；发酵工艺中采用特定的培养和发酵控制条件，与未经优化的无机培养基相比，发酵时间缩短20％，活性提高50％，产量提高20％以上；通过对纯化工艺进行优化，收率提高了30％。并且宿主残留蛋白和残留DNA已完全符合药典要求，表示经发明人大规模发酵的DP1、DF1已完全满足药用级要求。附图说明图1实施例1第一批次重组DP2毕赤酵母菌株中SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图1-a为实施例1第一批次重组DP2毕赤酵母菌株中SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇8h发酵上清液，泳道3为流加甲醇16h发酵上清液，泳道4为流加甲醇24h发酵上清液，泳道5为流加甲醇32h发酵上清液，泳道6为流加甲醇40h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP2条带。图1-b为实施例1第一批次重组DP2毕赤酵母菌株小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图2为实施例1第二批次重组DP2毕赤酵母菌株中SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图2-a为实施例1第二批次重组DP2毕赤酵母菌株中SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇6h发酵上清液，泳道3为流加甲醇12h发酵上清液，泳道4为流加甲醇18h发酵上清液，泳道5为流加甲醇24h发酵上清液，泳道6为流加甲醇30h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP2条带。图2-b为实施例1第二批次重组DP2毕赤酵母菌株小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图3为实施例1第三批次重组DP2毕赤酵母菌株SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图3-a为为实施例1第三批次重组DP2毕赤酵母菌株中SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为流加甲醇0h发酵上清液，泳道2为流加甲醇6h发酵上清液，泳道3为流加甲醇12h发酵上清液，泳道4为流加甲醇18h发酵上清液，泳道5为流加甲醇24h发酵上清液，泳道6为流加甲醇30h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP2条带。图3-b为实施例1第三批次重组DP2毕赤酵母菌株小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图4为重组DP2毕赤酵母菌株实施例2中SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图4-a为重组DP2毕赤酵母菌株实施例3中SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为补料前发酵上清液，泳道2为流加甲醇4h发酵上清液，泳道3为流加甲醇8h发酵上清液，泳道4为流加甲醇12h发酵上清液，泳道5为流加甲醇18h发酵上清液，泳道6为流加甲醇27h发酵上清液，泳道7为流加甲醇30h发酵上清液，，其中箭头所指即为重组DP2条带。图4-b为重组DP2毕赤酵母菌株实施例2中小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图5为重组DP2毕赤酵母菌株实施例3中SDS-PAGE电泳图以及发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。其中，图5-a为重组DP2毕赤酵母菌株实施例3中SDS-PAGE电泳图，泳道M为10-230kDa宽范围的蛋白上样Marker；泳道1为补料前发酵上清液，泳道2为流加甲醇0h发酵上清液，泳道3为流加甲醇6h发酵上清液，泳道4为流加甲醇12h发酵上清液，泳道5为流加甲醇18h发酵上清液，泳道6为流加甲醇24h发酵上清液，泳道7为流加甲醇30h发酵上清液，泳道8为流加甲醇36h发酵上清液，其中箭头所指即为重组DP2条带。图5-b为重组DP2毕赤酵母菌株实施例3中小规模高密度发酵液OD600和菌体湿重变化趋势图。图6为DP2发酵液上清pH4.0第一步纯化结果。其中，图6-a为DP2发酵液第一步纯化色谱图；图6-b为DP2发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品；泳道4-10为纯化洗脱峰各收集管。图7为DP2发酵液上清pH5.0第一步纯化结果。其中，图7-a为DP2发酵液第一步纯化色谱图；图7-b为DP2发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品；泳道4-10为纯化洗脱峰各收集管。图8为DP2发酵液上清pH6.0第一步纯化结果。其中，图8-a为DP2发酵液第一步纯化色谱图；图8-b为DP2发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品；泳道4-10为纯化洗脱峰各收集管。图9为DP2蛋白pH6.0第二步纯化结果。其中，图9-a为DP2蛋白第二步纯化色谱图；图9-b为DP2蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为纯化穿透样品，泳道3为洗脱样品，泳道4为非预染蛋白Marker。图10为DP2蛋白pH7.5第二步纯化结果。其中，图10-a为DP2蛋白第二步纯化色谱图；图10-b为DP2蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4为洗脱样品。图11为DP2DF2蛋白pH9.0第二步纯化结果。其中，图11-a为DP2蛋白第二步纯化色谱图；图11-b为DP2蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品，泳道4为洗脱样品。图12为DP2蛋白pH6.0第三步纯化结果。其中，图12-a为DP2蛋白第三步纯化色谱图；图12-b为DP2蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-9为洗脱峰各收集管样品。图13为DP2蛋白pH7.0第三步纯化结果。其中，图13-a为DP2蛋白第三步纯化色谱图；图13-b为DP2蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-9为洗脱峰各收集管样品。图14为DP2蛋白pH8.0第三步纯化结果。其中，图14-a为DP2蛋白第三步纯化色谱图；图14-b为DP2蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-8为洗脱峰各收集管样品。图15为DP2蛋白纯度HPLC分析结果。其中图15-a为DP2蛋白RP-HPLC分析结果；图15-b为DF2蛋白RP-HPLC分析结果。图16为DP2DF2蛋白氨基酸覆盖率分析结果。其中图16-a为DP2蛋白氨基酸覆盖率分析结果；图16-b为DF2蛋白氨基酸覆盖率分析结果。图17为DP2与阳性血清库反应抑制曲线。图18为DP2300L发酵液上清第一步纯化结果。其中，图18-a为DP2发酵液第一步纯化色谱图；图18-b为DP2发酵液第一步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为11-94KD非预染蛋白Marker，泳道2为纯化前样品，泳道3为纯化穿透样品；泳道4为洗脱峰1，泳道5-8为洗脱峰2。图19为DP2蛋白第二步纯化结果。其中，图19-a为DP2蛋白第二步纯化色谱图；图19-b为DP2蛋白第二步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为11-100KD非预染蛋白Marker，泳道3为纯化后样品，泳道4为洗脱样品。图20为DP2蛋白第三步纯化结果。其中，图20-a为DP2蛋白第三步纯化色谱图；图20-b为DP2蛋白第三步纯化SDS-PAGE分析图，泳道1为纯化前样品，泳道2为非预染蛋白Marker，泳道3为纯化穿透样品，泳道4-10为洗脱峰各收集管样品。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1重组DP2DF2小规模3L高密度发酵工艺步骤1：重组菌株活化取冻存于-80℃的DP2工作种子库中甘油菌种子于YPD固体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，琼脂糖15gL划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。步骤2：种子液培养挑取固体培养基上单克隆菌落于YPD液体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，30℃，220rpm培养至OD600≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用种子液。步骤3：发酵过程洗净赛多利斯B-plus生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后配置BSM培养基作为发酵培养基不同发酵批次BSM浓度见表1，倒入罐中，121℃高压灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝6.5±0.2。将步骤2中得到的种子液按照1:15VV，种子液发酵培养基比例接入生物反应器中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为27℃，pH＝5.5±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM12.4mlL。此阶段大约22h，期间DO持续下降，通过增加搅拌转速、通气量以及通氧气将DO维持在20％，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到120gL，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的3h以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，3h后补料速度上调为60mlh-1L-1。补加6h，菌体湿重约250gL，停止补料，DO上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。不同发酵批次诱导条件见表1并维持DO不高于30％，进行发酵表达，诱导开始后，每隔一段时间开始取样，同时在诱导初期中进行DOSPIKE，保证发酵罐罐内甲醇无积累，测发酵液OD600吸收值以及菌体湿重。图1-3为三个批次菌体湿重发酵期间变化趋势图。表1重组DP2小规模高密度发酵工艺条件优化其中，BSM发酵培养基即是指life的发酵说明书上确定的标准浓度，即指K2SO418.2gL，MgSO414.9gL，KOH0.93gL，CaSO44.13gL，H3PO426.7mLL，甘油40gL，40％的BSM发酵培养基即是指life的发酵说明书上确定的标准浓度基础上各成分浓度都降为40％，即K2SO47.28gL，MgSO45.96gL，KOH0.372gL，CaSO41.652gL，H3PO410.68mLL，甘油16gL。重组DP2的上述发酵工艺对重组DF2同样适用。实施例2重组DP2DF2大规模30L高密度发酵验证步骤1：重组菌株活化取冻存于-80℃的工作种子库中甘油菌种子于YPD固体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，琼脂糖15gL划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。步骤2：一级种子液培养挑取步骤1中固体培养基上单克隆菌落于YPD液体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，30℃，220rpm培养至OD600≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用一级种子液。步骤3：二级种子液培养将步骤2中获得的一级种子液接种至赛多利斯B-plus发酵罐中，并以60％BSM，pH＝5.5±0.2，27℃，300rpm值培养，通过通气和转速条件是溶氧保持在25％，最终至OD600≈40，湿重达到约80gL，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用二级种子液。步骤4：发酵过程洗净赛多利斯Cplus生物反应器，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后按照实施例1中关键工艺参数的设计区间，确定发酵培养基为60％BSM进行配置发酵培养基20L，并倒入发酵罐中，121℃在线灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝5.5±0.2。将步骤3中得到的种子液按照1:15VV，种子液发酵培养基比例接入发酵罐中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为27℃，pH＝6.5±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM12mlL。此阶段大约20h，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到100gL，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的2h以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，2h后补料速度上调为60mlh-1L-1。补加4h，菌体湿重约200gL，停止补料，DO上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。调节pH＝6.5±0.2，以甲醇流加速度为30mlh-1L-1进行诱导表达重组DP2；维持DO不高于40％，诱导温度为20～22℃，pH＝6.0±0.2，进行发酵表达，发酵开始后每隔一段时间取样一次，测发酵液OD600吸收值以及菌体湿重，图4-b为重组DP2大规模发酵液OD600吸收值以及菌体湿重发酵期间变化趋势图，由图可知，在重组毕赤酵母发酵期间，发酵液OD600均能达到300以上，且菌体湿重均能达到400gL。诱导40h发酵结束后，离心收集上清，SDS-PAGE电泳鉴定甲醇诱导不同时间的重组DP2产量图4-a，说明发酵液OD600吸收值、菌体湿重变化趋势以及发酵产物均与3L小规模高密度发酵保持一致。申请人因此确定，本发明的发酵工艺，完全能够进行产业化放大生产。重组DP2的上述发酵工艺对重组DF2同样适用。实施例3重组DP2DF2中试300L高密度发酵验证步骤1：重组菌株活化取冻存于-80℃的工作种子库中甘油菌种子于YPD固体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，琼脂糖15gL划线，30℃恒温恒湿箱培养3-5天。步骤2：一级种子液培养挑取步骤1中固体培养基上单克隆菌落于YPD液体培养基酵母提取物10gL，蛋白胨20gL，葡萄糖20gL，30℃，220rpm培养至OD600≈6.0，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用一级种子液。步骤3：二级种子液培养将步骤2中获得的一级种子液接种至迪沃信BVT-3000型30L种子罐中，并以60％BSM，pH＝5.5±0.2，27℃，300rpm值培养，通过通气和转速条件是溶氧保持在25％，最终至OD600≈40，湿重达到约80gL，并在显微镜下观察无杂菌，即得到发酵用二级种子液。步骤4：发酵过程洗净迪沃信BVT-3000型300L发酵罐，用pH＝7.0和pH＝4.0的标准液分别校正发酵罐的pH计探头，然后按照实施例1中关键工艺参数的设计区间，确定发酵培养基为60％BSM进行配置发酵培养基100L，并倒入发酵罐中，121℃在线灭菌20min，待温度降到50℃后，用浓氨水调pH＝5.5±0.2。将步骤3中得到的种子液按照1:10VV，种子液发酵培养基比例接入发酵罐中。初期重组毕赤酵母菌体增殖阶段发酵温度为27℃，pH＝6.5±0.2，转速＝300rpm培养，DO值100％，添加PTM12mlL。此阶段大约20h，当碳源消耗完毕后，溶氧值迅速上升，菌体湿重达到100gL，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始的2h以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，2h后补料速度上调为60mlh-1L-1。补加4h，菌体湿重约200gL，停止补料，DO上升，表明碳源耗尽，进入诱导阶段。以甲醇流加速度为30mlh-1L-1进行诱导表达重组DP2；维持DO不高于40％，诱导温度为20～22℃，pH＝6.0±0.2，进行发酵表达，发酵开始后每隔一段时间取样一次，测发酵液OD600吸收值以及菌体湿重，图5-b为重组DP2大规模发酵液OD600吸收值以及菌体湿重发酵期间变化趋势图图。诱导40h发酵结束后，离心收集上清，SDS-PAGE电泳鉴定甲醇诱导不同时间的重组DP2产量图5-a，说明发酵液OD600吸收值、菌体湿重变化趋势以及发酵产物均与3L小规模、30L大规模高密度发酵保持一致。申请人因此确定，本发明的发酵工艺，完全能够进行产业化放大生产。重组DP2的上述发酵工艺对重组DF2同样适用。实施例4重组DP2DF230L发酵液纯化工艺一、重组DP2发酵液上清第一步纯化步骤1、发酵液的预处理按上述实施例中得到的发酵液高速离心，得到上清液；加入硅藻土助滤，过滤得到澄清的发酵液样品；用3KD膜包超滤稀释，降低电导至5mScm以下。步骤2、阳离子交换层析将上述处理后的发酵液上清乙酸调节pH4.0，上SPFF层析柱，柱型为BPG140100，柱床体积2800ml，平衡缓冲液为50mMNaAc，pH4.0，洗脱缓冲液为50mMNaAc，1.0MNaCl，pH4.0，按照0-100％线性洗脱，DP2DF2目的蛋白主要集中在第二个洗脱峰，图6-a为DP2蛋白第一步纯化色谱图，图6-b为DP2蛋白第一步纯化SDS-PAGE分析图。步骤1、2的其余步骤不变，调节样品和缓冲液pH5.0。图7-a为DP2蛋白第一步纯化色谱图，图7-b为DP2蛋白第一步纯化SDS-PAGE分析图。步骤1、2的其余步骤不变，调节样品和缓冲液pH6.0。图8-a为DP2蛋白第一步纯化色谱图，图8-b为DP2蛋白第一步纯化SDS-PAGE分析图。由图6至图8结果可知，随着pH增加，得到的DP2蛋白纯度更高，杂质更少，利于后续的纯化处理，其中pH6.0为最佳条件。二、重组DP2蛋白第二步纯化步骤1、超滤合并实施例步骤2中第二个洗脱峰，3KD膜包超滤稀释至电导95％。重组DP2的上述纯化工艺对重组DF2同样适用。实施例7重组DP2DF2300L发酵液纯化样品蛋白活性分析按照实施例5步骤4中活性检测方法对300L发酵液制备得到的DP2和DF2蛋白进行活性检测，以30L发酵液制备得到的样品和天然蛋白作为比较，表6显示300L发酵及纯化样品与30L及天然蛋白基本一致，处于相同水平；说明发酵及纯化工艺得到了较好的放大。表6：300L发酵纯化样品与30L发酵纯化及天然蛋白活性值比较

权利要求：1.重组尘螨II型变应原DP2和DF2蛋白的制备方法，包括发酵工艺和纯化工艺，发酵过程包括重组酵母菌株活化、种子液培养、高密度发酵，其特征在于，所用发酵培养基为40～60％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：20～25℃，pH值为6.0-6.5。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所用发酵培养基为60％BSM培养基，高密度发酵的诱导阶段诱导温度为：20～22℃，pH值为6.0。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，高密度发酵的诱导阶段甲醇流加速度为30mLh-1L-1，并维持DO不高于40％。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，高密度发酵的限速生长阶段开始以30mlh-1L-1的速率补加50％甘油，后补料速度上调为60mlh-1L-1。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的纯化工艺为三步纯化，包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，阳离子交换层析的纯化填料为SPFF；pH范围4.0-6.0。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，阴离子交换层析的纯化填料为QFF；pH范围6.0-9.0；电导值2.0mScm-20.0mScm。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，疏水层析的纯化填料为phenylFF；pH范围6.0-8.0；硫酸铵浓度为1.0-2.0M。

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