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申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明公开了一株稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒及其构建方法与应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将一段C38‑mCherry‑T2A基因序列SEQIDNO.1插入到GI型日本脑炎病毒基因组的5′UTR与C基因之间，构建获得含有T7启动子的重组病毒感染性克隆。利用体外转录技术获得重组病毒的基因组RNA全长，并转染至BHK‑21细胞中，当细胞出现典型的病变时，收取细胞上清即可获得表达mCherry蛋白的重组病毒。该重组病毒能够稳定高效地表达mCherry蛋白，插入的mCherry基因在病毒连续传代过程中具有遗传稳定性，且不影响病毒蛋白的翻译、加工以及病毒的复制能力。本发明所述的稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒在抗病毒药物筛选方面具有广泛的应用价值。

主权项：1.一株稳定表达红色荧光蛋白mCherry的重组GI型日本脑炎病毒的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：（1）携带mCherry基因的全长感染性克隆的构建；在GI型日本脑炎病毒基因组5′非编码区UTR与C基因之间，插入一段C38-mCherry-T2A基因序列，C38-mCherry-T2A基因序列为SEQIDNO.1，从而构建携带有荧光蛋白基因的重组病毒基因组；具体步骤：使用SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示引物扩增片段SEQIDNO.4；使用SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示引物扩增片段SEQIDNO.7；扩增出的DNA片段进行回收检测；SEQIDNO.1基因片段由人工合成；相邻DNA片段间有20～30bp的同源序列；将SEQIDNO.1、SEQIDNO.4、SEQIDNO.7片段与用NotI和SacII酶处理的线性化感染性克隆载体TAR-rGI进行等比例混合，并利用NEBGibsonAssembly重组酶进行同源重组；随后，转化大肠杆菌Top10中，挑取单克隆菌落进行扩增与质粒提取，鉴定并测序正确的质粒命名为TAR-rGI-mCherry；重组病毒的拯救；用限制性内切酶SalI将质粒TAR-rGI-mCherry进行线性化处理后，利用NEBHiScribeT7HighYieldRNASynthesisKit对线性化的TAR-rGI-mCherry质粒进行体外转录，获得重组病毒的基因组RNA全长；将重组病毒RNA直接转染至生长为70％的BHK-21细胞中，并将转染后的细胞置于37℃、含有5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞出现典型的病变并表达明显的红色荧光蛋白，即获得重组GI型日本脑炎病毒，命名为rGI-mCherry。

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