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申请/专利权人：武汉真福医药股份有限公司

摘要：本发明公开了一种QK纤溶酶基因‑水蛭素基因融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转回到感受态细胞中，筛选出高效表达蛋白菌株，扩大培养细胞和诱导表达融合蛋白，得到QK纤溶酶基因‑水蛭素融合蛋白。本发明的QK纤溶酶‑水蛭素融合蛋白既保留了QK纤溶酶的靶向溶栓功效，又能发挥水蛭素的抗凝作用；不但抑制蛋白水解酶的降解，而且增大蛋白分子量，降低肾小球通过率，使得药物半衰期得以延长，在临床上就可以降低使用剂量或减少注射频率。

主权项：1.一种QK纤溶酶基因-水蛭素基因融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转回到感受态细胞中，筛选出高效表达蛋白菌株，扩大培养细胞和诱导表达融合蛋白，得到QK纤溶酶基因-水蛭素融合蛋白；以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，包括以下步骤：将QK纤溶酶的基因序列和水蛭素的基因序列分别进行扩增，得到两个扩增片段，分别进行KpnI酶切处理，得两个酶切产物，再利用连接酶对两个酶切产物进行融合处理，得到融合基因序列；将QK纤溶酶的基因序列和水蛭素的基因序列分别进行扩增，包括以下步骤：QK纤溶酶的基因序列含有调控序列、信号肽序列、前肽序列、成熟肽序列以及终止序列；扩增QK纤溶酶的基因序列中的调控序列、信号肽序列、前肽序列及成熟肽序列，除去终止序列、在3′端引入kpnI酶切识别位点，5′端引入BanHI酶切位点；以QK纤溶酶的基因序列、水蛭素的基因序列为模板，经过扩增拼接取得融合基因序列，包括以下步骤：在5′端引入KpnI酶切位点以及起始密码ATG，3′端为TAG、TAA两个终止密码及EcoRI酶切位点；QK纤溶酶-水蛭素融合基因序列如下：GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACGATGGCGTTCAGCAACATGTCTGCGCAGGCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAGAAATACATTGTTGGATTTAAACAGACAATGAGTGCCATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGTTCAAAAGCAGTTTAAGTATGTTAACGCAGCCGCAGCAACATTGGATGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAAACAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAAGATCATATTGCACATGAATATGCGCAATCTGTTCCTTACGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGCTACACAGGCTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAACGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTACCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGGACGCAGTTCTCACGGCACACACGTAGCCGGTACGATTTCCGCTTTTAATAACTCAATCGGTGTTCTGGGCGTAGCGCCAAACGCATCGTTATATGCAGTAAAAGTTCTTGACTCAACAGGAAGCGGCCAATACAGCTGGATTATTAACGGCATTGAGTGGGCTATTTCCAACAATATGGATGTTATCAACATGAGCCTTGGCGGACCTTCTGGATCTACAGCTCTGAAAACAGTCGTTGATAAAGCAGTTTCCAGCGGTATCGTCGTTGCTGCCGCTGCCGGAAACGAAGGTTCATCGGGCAGCACAAGCACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACCATTGCGGTAGGTGCGGTAAACAGCAGCACCCAAAGAGCTTCATTCTCAAGCGCAGGTTCTGAGCTTGATGTAATGGCTCCTGGCGTGTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTACGGTGCTTACAACGGAACGTCAATGGCGACTCCTCACGTTGCCGGAGCAGCAGCGCTAATTCTTTCTAAGCATCCGACTTGGACAAACGCGCAAGTCCGTGATCGTTTAGAAAGCACTGCAACATATCTTGGAAACTCTTTCTACTATGGAAAAGGGTTAATCAACGTACAAGCAGCTGCACAATAATTCTCTACCAAGGTCCTTGTTTTTGCTGCCCTGTGCATTTGCTTGACCCATGCAATGACCTATAAGGATTGCACAGCCGATACCACGACTGGATGCTTATGCGGGGGGCATCTCTGCACTGGAGCCTGTGCAAATGACAAGTGCAACAAAAATGATAGGGGAACCTACGTCAAACAGACCGTCGACGACGTCTTTGAAAGTTTTTCATTGGATGGGGAGAATTAA。

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