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申请/专利权人：无锡极氪精准医学检验有限公司

摘要：本发明公开了一种彗星实验方法，属于单细胞检测技术领域。其通过本发明设计的用于彗星实验方法的载片，其实验区（11）的上表面设有磨砂层Ⅱ，实验区（11）内设有若干个阵列排布的光滑实验窗口（12）；所述盖片Ⅰ（2）一对一覆盖在光滑实验窗口（12）的上方；所述盖片Ⅱ（3）同时覆盖所有光滑实验窗口（12），通过激光刻蚀工艺形成防溢槽Ⅰ（16）和或防溢槽Ⅱ（17），进一步巩固了凝胶与载片本体（1）间的粘附力，并避免凝胶溢出导致的样品间交叉污染，同时改进了传统彗星实验方法，提供了一种解决脱胶问题的彗星实验方法，该方法的样品制备工艺简单、易于操作。

主权项：1.一种彗星实验方法，其工艺过程如下：步骤一、准备用于彗星实验方法的载片：所述用于彗星实验方法的载片包括载片本体（1）和盖片，所述盖片包括盖片Ⅰ（2）和盖片Ⅱ（3），所述盖片Ⅰ（2）和盖片Ⅱ（3）先后覆盖在载片本体（1）上方使用，所述载片本体（1）的正面设有实验区（11）和记录区（14），记录区（14）设置在实验区（11）的左侧或右侧；在实验区（11）丝印一层由阻熔剂形成的若干个阵列排布的图案纹样，并风干；选择蒙砂膏Ⅰ，使用排笔Ⅰ涂刷记录区（14），再选择蒙砂膏Ⅱ，所述蒙砂膏Ⅱ的蒙砂粉的目数小于蒙砂膏Ⅰ的蒙砂粉的目数，换排笔Ⅱ涂刷实验区（11），将载片本体（1）放入烤箱，经过580~600℃的高温烘烤2至3小时，图案纹样处形成光滑实验窗口（12），没有图案纹样处的蒙砂面便熔融在载片本体（1）的表面上，分别形成记录区（14）的磨砂层Ⅰ和实验区（11）的磨砂层Ⅱ；所述盖片Ⅰ（2）的尺寸大于等于32个光滑实验窗口（12）的最长尺寸，且小于等于2个光滑实验窗口（12）的最长尺寸；所述盖片Ⅱ（3）呈大矩形，盖片Ⅱ（3）的长度=载片本体（1）的长度-记录区（14）的宽度，其同时覆盖所有光滑实验窗口（12），但露出记录区（14）；步骤二、准备0.6%低熔点琼脂糖凝胶：0.3gLMA溶于50mlPBS中，微波炉加热至完全熔化，形成低熔点琼脂糖凝胶的质量浓度为0.6%，室温放置；步骤三、铺第一层胶：PBS重悬细胞，调整细胞密度为4×105个mL，按照1:10vv将细胞悬液与熔化后的0.6%低熔点琼脂糖于37℃在EP管中充分混合，吸取20uL混合液滴加至载片本体（1）的光滑实验窗口（12）内，盖片Ⅰ（2）一对一覆盖在光滑实验窗口（12）的上方，运用压片法使凝胶充分延展至盖片Ⅰ（2）的边缘，厚度适中，从光滑实验窗口（12）蔓延至周边磨砂层Ⅱ的区域，最终形成表面平整并与盖片Ⅰ（2）形状一致的样品凝胶层；4℃避光固化15min，用指腹移开盖片Ⅰ（2），载片本体（1）上即留下样品凝胶层；步骤四、铺第二层胶：按照体积比1:10将PBS缓冲液与熔化后的0.6%低熔点琼脂糖凝胶在37℃充分混合，吸取150uL混合液滴加至载片本体（1）上，加盖盖片Ⅱ（3），使用压片法制造形成覆盖所有样品凝胶层及周边磨砂层Ⅱ的区域的辅助凝胶层，厚度适中，4℃避光固化15min，用指腹移开盖片Ⅱ（3）；步骤五、裂解：将载片本体（1）转移至4℃预冷的裂解液中，4℃裂解1h-2h，取出载片本体（1）并沥去多余液体，蒸馏水浸洗2次，每次2min；步骤六、解旋：将载片本体（1）转移至新鲜配制的碱性电泳液中，室温避光解旋20min；步骤七、电泳：水平电泳仪中倒入4℃预冷的碱性电泳液，将载片本体（1）轻柔浸没其中，按照1Vcm设定电压，在电流300mA条件下电泳15-30min；步骤八、中和及烘干：取出载片本体（1）并沥去多余液体，蒸馏水浸洗2次，每次2min；转移载片本体（1）至70%酒精溶液中，室温放置5min后取出沥干，37℃烘干15-25min至胶完全干燥；步骤九、染色：在样品孔区域按30uL孔滴加染色液，室温避光染色10min，蒸馏水浸洗2次，每次2min；步骤十、拍照：在535nm激发波长下进行图片采集与分析。

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