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申请/专利权人：北京市理化分析测试中心

摘要：本发明提供了一种基于血痕miRNA的年龄预测方法，属于基因工程技术领域，包括：裂解血痕样本，得到裂解液；将裂解液与氯仿混合、离心，得到水相；将水相与检测外参、异丙醇混合、离心，得到miRNA；将miRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA进行荧光定量PCR，计算miRNA的表达量；按照公式年龄＝22.578×log10miR‑374c‑5p表达量‑12.18×log10miR‑32‑3p表达量‑7.268×log10miR‑32‑5p表达量+27.64。本发明检测灵敏度高，仅需要5mm2的血痕即可实现年龄预测，准确度高和分析效率高。

主权项：1.一种基于血痕miRNA的年龄预测方法，其特征在于，包括如下步骤：1将血痕样本与Trizol试剂混合、震荡裂解，得到裂解液；所述血痕样本的面积不少于5mm2；所述血痕样本的面积与Trizol试剂的体积比为1cm2:1mL；2将所述步骤1得到的裂解液静置15min后，与氯仿混合、静置2～3min后进行第一离心，得到水相；所述第一离心的时间为15min；3将所述步骤2得到的水相与检测外参cel-MiR-39、异丙醇混合，得到混合液，将所述混合液静置10min后进行第二离心，得到miRNA；所述第二离心的时间为10min；4将所述步骤3得到的miRNA逆转录为cDNA，将所述cDNA进行荧光定量PCR，得到miRNA中miR-374-5p、miR-32-5p和miR-32-3p的Ct值，得到cel-miR-39的Ct值；所述miR-374-5p、miR-32-5p和miR-32-3p的Ct值分别减去cel-miR-39的Ct值，得到miR-374-5p、miR-32-5p和miR-32-3p的△Ct值，按照公式2-（△Ctsample-△Ctcontrol）计算miR374-5p、miR-32-5p和miR-32-3p的表达量，得到miR-374-5p表达量、miR-32-5p表达量和miR-32-3p表达量；所述miR-374-5p、miR-32-5p和miR-32-3p的△Ctcontrol分别为16.015、16和18.814；5按照以下公式预测年龄，年龄=22.578×log10miR-374c-5p表达量-12.18×log10miR-32-3p表达量-7.268×log10miR-32-5p表达量+27.64；所述逆转录的体系每20μL包括1μLmiRNA溶液、2μL10×Reactionbuffer、1μL1mMATP、1μL10μMRTprimer、1μLdNTPmix、0.5μL浓度为200UμL的MMuLVreversetranscriptase和0.2μL浓度为5,000UmL的E.colipolyApolymerase，13.3μL无核酶水；所述miRNA溶液中miRNA的浓度500μgL；所述逆转录的程序为：42℃60min；95℃5min；4℃5min；所述步骤4荧光定量PCR的程序为：95℃15min；94℃20s，64℃30s，72℃34s，5个循环；94℃20s，60℃34s，40个循环；所述荧光定量PCR的体系每10μL包括：SYBR®Greenmaster5μL、PCRprimermix1μL和DilutedcDNAtemplate4μL；所述PCRprimermix包括扩增miR-374-5p、miR-32-3p、miR-32-5p和Cel-miR-39的引物对；扩增miR-374-5p的引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1~2所示，扩增miR-32-3p的引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3~4所示，扩增miR-32-5p的引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5~6所示，扩增Cel-miR-39的引物的核苷酸序列如SEQIDNo.7~8所示。

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