买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：北京市理化分析测试中心

摘要：本发明公开了陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法，包括陈旧血痕样品的预处理，miRNA的提取以及miRNA测序文库构建的步骤，其中文库构建包括：①miRNA5’和3’接头的连接；②反转录；③PCR扩增；④PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145‑160bp大小的片段，即得测序文库。采用本发明方法可实现在48小时内完成对陈旧血痕miRNA文库的构建，最少仅需5cm2陈旧血痕约含10ng‑100ngRNA样品即可。有利于对陈旧法医物证的再利用，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。

主权项：1.陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A、陈旧血痕样品的预处理；B、miRNA的提取；C、miRNA测序文库的构建，步骤如下：C1、miRNA5’和3’接头的连接；C2、反转录；C3、PCR扩增；C4、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp大小的片段，即得测序文库；步骤A预处理的具体方法为：取5cm2陈旧血痕样品，剪碎至3-5mm2，加入200-400μl裂解液，室温静置10min，然后振荡器振荡混匀30sec；步骤B进行miRNA提取的具体方法为：B1、经预处理后的样品室温放置5min，然后室温12000rpm离心10min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；B2、加入200-400μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min；然后室温12000rpm离心15min，样品分层，将无色的水相转移至新管中；B3、量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积13体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRspin，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，收集流出液；B4、量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积23体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRelute，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，离心后弃流出液，保留吸附柱miRelute；B5、向吸附柱miRelute中加入500-1000μl去蛋白液，室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；B6、向吸附柱miRelute中加入500-1000μl漂洗液，室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；B7、重复操作步骤B6；B8、将吸附柱miRelute放入收集管中，室温12000rpm离心1min，去除残液；B9、向吸附柱miRelute中加入20-40μlRNAasefree水，静置15min，加入新离心管中，室温12000rpm离心5min，收集流出液进行RNA浓度检测后直接用于文库构建或于-80℃保存；步骤C1具体方法如下：C1a、连接3’接头①配制如下反应体系：RNA3’Adapter1μl总RNA5μl其中，总RNA起始量为10ng；上述体系充分混匀；70℃孵育2min，然后立即置于冰上；②在一个新的PCR管中配制如下反应体系：LigationBuffer2μlRNaseInhibitor1μlT4RNALigase21μl③将步骤②的体系与步骤①得到的体系充分混合，28℃孵育1h；向混合体系中加入1μlStopSolution，混匀；继续于28℃孵育15min，然后立即置于冰上，得到3’接头连接产物；C1b、连接5’接头④将1.1μlRNA5’Adapter加至一个新的PCR管中，70℃孵育2min，然后立即置于冰上；向管中加10mMATP1.1μl，充分混匀；再加入1.1μlT4RNALigase，充分混匀；将3μl上述混合液加入装有11μl3’接头连接产物的PCR管中，充分混匀，然后于28℃孵育1h，然后置于冰上，得到5’和3’接头连接产物；步骤C2进行反转录的具体方法为：C2a、将5’和3’接头连接产物浓缩至6μl，向其中加入1μlRNARTPrimer，充分混匀后短暂离心；70℃孵育2min，然后立即置于冰上；C2b、在一个新的PCR管中，冰上配制如下反应体系： 上述体系充分混匀后短暂离心；将步骤C2b所得体系加入C2a的混合液中制备好的样品中，于50℃孵育1h，然后立即置于冰上；步骤C3进行PCR扩增的具体方法为：制备如下预混液： 上述预混液充分混匀后短暂离心，将制备的预混液加入装有步骤C2所得反转录溶液的PCR管中，按照如下条件进行PCR扩增：98℃30sec；98℃10sec，60℃30sec，72℃15sec，15个循环；72℃10min；步骤C4的具体方法如下：C4a、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp大小的片段；C4b、溶胶⑤将切下的胶块0.01克放入自制的gelbreakertube管中，再将自制的gelbreakertube管放入将含有200μl溶胶液的2ml离心管中，20000g离心2min；将200ml枪头剪去尖端部位，吸取2ml离心管中液体转移至含有300μl超纯水的2ml离心管中；以40转分速度置于摇床上室温摇匀过夜；其中，所述自制的gelbreakertube离心管是用针头将0.5ml离心管底部扎10个孔，各孔孔径为0.2mm；所述溶胶液的制备方法为：取54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5molLpH8.0EDTA，加蒸馏水至1000ml，得到储液，使用时将储液稀释10倍即为溶胶液；⑥将过夜溶解后的胶块转移至孔径为5μm的滤管，室温600g离心30sec，然后向其中加入2μlGlycogen，30μl3M醋酸钠，975μl预冷无水乙醇，充分混匀，4℃，20000g离心20min，弃上清，向沉淀中加入500μl70％酒精洗涤，室温20000g离心2min，弃上清，开盖晾干沉淀，用10μl10mMTris-HCl溶解沉淀，所得文库经过质检，用于IlluminaHiseq2000或FGx高通量测序；步骤A中使用的裂解液为MZ，步骤B中使用的去蛋白液为MRD，漂洗液为RW，步骤B中使用的吸附柱miRspin、吸附柱miRelute，上述试剂及柱均来自于天根miRNA提取试剂盒；步骤C中使用的RNA3’Adapter为RA3，LigationBuffer为HML，T4RNALigase2，StopSolution为STP，5’Adapter为RA5，T4RNALigase，Firststrandbuffer，PCRmix为PML，RNAPCRPrimer为RP1，RNAPCRPrimerIndex为RPIX，上述试剂均来自于IlluminamiRNA文库构建试剂盒。

全文数据：陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法技术领域[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法。背景技术[0002]个体识别是法医物证的重要任务，是用来揭示个体身份，侦查破案、抚恤赔偿的重要环节。传统的个体识别方法基于基因组DNA短串联重复序列（ShortTandemRepeats，STRs、单核苷酸多态性SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs分析等。这些方法对模板量及完整度要求较高，当模板量过少或降解时均会影响检测结果的准确性。同时也无法对检材的组织、体液来源及个体特征进行判断。[0003]早期的个体识别应用血型检验的方法，但血型检验常受多种条件的限制，血液变质、抗原型消失、酶活性下降均会影响血型检验的准确性，因此利用血型特征对降解检材进行同一认证存在局限性。随着分子生物学的高速发展，STRs，SNPs及PCR技术的应用，使法医物证鉴定的灵敏度达到超微量水平。[0004]目前法医学个体识别与亲子鉴定领域主要应用STRs技术。STRs广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性。随着我国DNA数据库建设的逐渐开展，利用网络系统、比对，使通过DNA分析进行个体识别有了新的突破。但现有DNA分析方法还存在局限性。首先DNA易降解，在面临痕量物证及降解检材时无法做到有效分析，其次现有技术无法实现体液、组织来源鉴定。寻找适用于痕量降解检材同时能够提供组织来源等信息的个体识别标记物成为法庭科学研究的热点。[0005]近年来针对法庭科学领域新标记物的研究给法医个体识别与身份匹配、案发现场鉴定与混合斑迹来源鉴定等方面带来了新的契机。目前深入研究的新型遗传标记有RNA，DNA甲基化、线粒体DNA等。主要集中于体液斑鉴定、同卵双生子鉴别和年龄推断等方面。近年来，microRNAmiRNA是一类长度为16-22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，近年来受到人们广泛关注。目前在人体内发现2588种miRNA，针对miRNA的研究主要集中于遗传、发育与疾病发生等方面。在法庭科学领域，针对miRNA的研究主要集中于体液斑鉴定。miRNA相关的SNP同样具有广阔的法医学研究前景。目前已报道的miRNA-SNPs超过2300个，近年来针对miRNA多态性研究主要集中于miRNA-SNPs影响miRNA对靶基因的调控，及其在结肠癌、乳腺癌等疾病发生、发展中的作用。miRNA-SNPs由于具有丰富的多态性和较强的稳定性，具有应用于同一认定的潜能。[0006]法医实际案例中的检材通常具有微量、易降解、成分复杂等特点。目前法医DNA分析在腐败、降解检材等案件中的应用仍然有一定的局限性。而miRNA由于具有长度较短，不易降解等特点，其作为法医新遗传标记的研究具有可观的前景。此外，作为一种调控因子，miRNA具有明显的细胞特异性和组织特异性，可以通过miRNA实现对不同体液类型初步鉴另Ij。目前应用新一代测序技术已经成为探究miRNA表达谱的新方法。现在miRNA提取与建库方法都针对新鲜血液样本与组织细胞等，所需的miRNA模板量较高，通常需要IOOng以上总RNA，无法应用于痕量血痕。目前针对法医学样本例如陈旧血痕的miRNA文库构建方法及测序方法目前尚无报道。发明内容[0007]本发明的目的是提供陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法。[0008]为了实现本发明目的，本发明提供的陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法，包括以下步骤：[0009]A、陈旧血痕样品的预处理；[0010]B、miRNA的提取；[0011]C、miRNA测序文库的构建，步骤如下：[0012]CUmiRNA5’和3’接头的连接；[0013]C，2、反转录；[0014]C3、PCR扩增；[0015]C4、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp优选145bp左右大小的片段，即得测序文库。[0016]步骤A预处理的具体方法为:取5cm2陈旧血痕样品（约含有RNAIOng-IOOng，剪碎至3-5mm2,加入200-400μ1优选200μ1裂解液MZ，室温静置lOmin，然后振荡器振荡混匀30sec〇[0017]步骤B进行miRNA提取的具体方法为：[0018]B1、经预处理后的样品室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；然后室温12000rpm离心IOmin，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；[0019]B2、加入200-400μ1优选200μ1氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min;然后室温12000rpm离心15min，样品分层（分3层，S卩黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要存在于水相中），将无色的水相转移至新管中；[0020]B3、量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积13体积的无水乙醇如300μ1的转移液加1〇〇μ1无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）后转入吸附柱miRspin，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，收集流出液；[0021]B4、量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积23体积的无水乙醇，混匀此时可能会出现沉淀）后转入吸附柱miRelute，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，离心后弃流出液，保留吸附柱miRelute;[0022]B5、向吸附柱miRelute中加入500-1000μ1优选500μ1去蛋白液MRD预先加入乙醇），室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；[0023]B6、向吸附柱miRelute中加入500-1000μ1优选500μ1漂洗液RW预先加入乙醇），室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；[0024]B7、重复操作步骤B6;[0025]B8、将吸附柱miRelute放入收集管2ml收集管）中，室温12000rpm离心lmin，去除残液；[0026]B9、向吸附柱miRelute中加入20_40μ1优选20μ1RNAasefree水，静置15min，加入新离心管中，室温12000rpm离心5min，收集流出液进行RNA浓度检测约2ngAU后直接用于文库构建或于-80°C保存。[0027]步骤Cl具体方法如下：[0028]Cla、连接3’接头[0029]①配制如下反应体系：[0030]RNA3’AdapterRA3Ιμΐ[0031]总RNA5μ1[0032]其中，总RNA起始量为IOng;[0033]上述体系充分混匀;70°C孵育2min，然后立即置于冰上；[0034]②在一个新的PCR管中配制如下反应体系：[0035]LigationBufferHML2μ1[0036]RNaseInhibitorΙμΐ[0037]T4RNALigase2Ιμΐ[0038]③将步骤②的体系与步骤①得到的体系充分混合，28°C孵育Ih;向混合体系中加入ΙμΐStopSolutionSTP，用移液器充分混匀样品；继续于28°C孵育15min，然后立即置于冰上，得到3’接头连接产物；[0039]Clb、连接5’接头[0040]④将1.ΙμΐRNA5’AdapterRA5加至一个新的PCR管中，70°C孵育2min，然后立即置于冰上；向管中加IOmMATPΙ.ΐμΐ，充分混匀;再加入Ι.ΐμΐT4RNALigase，充分混匀；将3μ1上述混合液加入装有11μ13’接头连接产物的PCR管中，充分混匀，然后于28°C孵育lh，然后置于冰上，得到5’和3’接头连接产物此时体积约为14μ1。[0041]步骤C2进行反转录的具体方法为：[0042]C2a、将5’和3’接头连接产物浓缩至6μ1若浓缩体积过小，则加超纯水补足至6μ1，向其中加入ΙμΐRNARTPrimer，充分混匀后短暂离心;70°C孵育2min，然后立即置于冰上；[0043]C2b、在一个新的PCR管中，冰上配制如下反应体系：5XFirststrandbuffer2μΙ12,5mMdNTPmix0.5μ1[0044]IOOmMDTTlidRNaseInhibitorΙμΐSuperscriptIIReverseTranscriptaseIμΐ[0045]上述体系充分混匀后短暂离心；[0046]将步骤C2b所得体系加入C2a的混合液中制备好的样品中，于50°C孵育Ih，然后立即置于冰上。[0047]步骤C3进行PCR扩增的具体方法为：[0048]制备如下预混液：UltraPureWater8.5μ1PCRmixPML25Lii[0049]·RNAPCRPrimerRPl2μΙRNAPCRPrimerIndexRPIX2μ1[0050]上述预混液充分混匀后短暂离心，将制备的预混液加入装有步骤C2所得反转录溶液的PCR管中，按照如下条件进行PCR扩增：98°C30sec;98°C10sec，60°C30sec，72°C15sec，15个循环;72°ClOmin。[0051]步骤C4的具体方法如下：[0052]C4a、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp大小的片段；[0053]C4b、溶胶[0054]⑤将切下的胶块0.01克放入自制的gelbreakertube管中，再将自制的gelbreakertube管放入将含有200μ1溶胶液的2ml离心管中，20000g离心2min;将200ml枪头剪去尖端部位，吸取2ml离心管中液体（内含碎胶块转移至含有300μ1超纯水的2ml离心管中；以40转分速度置于摇床上室温摇匀过夜；[0055]其中，所述自制的gelbreakertube离心管是用针头将0.5ml离心管底部扎10个孔，各孔孔径为0.2mm;[0056]所述溶胶液的制备方法为：取54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5molLpH8.0HTA，加蒸馏水至IOOOml，得到储液，使用时将储液稀释10倍即为溶胶液；[0057]⑥将过夜溶解后的胶块转移至孔径为5μπι的滤管，室温600g离心30sec，然后向其中加入2μ1Glycogen，30μ13M醋酸钠，975μ1预冷无水乙醇，充分混匀，4°C，20000g离心20min，弃上清不要碰触底部沉淀。如果沉淀变得疏松，室温20000g再次离心2min，向沉淀中加入50^170%酒精（新鲜配制）洗涤，（轻弹试管底部，使沉淀悬浮）室温200008离心2min，弃上清不要碰触底部沉淀），开盖晾干沉淀，（可在37°C加热模块上放置5-10min至酒精完全干燥）用1〇μ1IOmMTris-HClpH8.5溶解沉淀，所得文库经过质检，用于IlluminaHiseq2000或FGx高通量测序。[0058]文库质检可利用安捷伦Agilent2100生物分析仪检测文库片段大小，利用KAPA文库定量试剂盒检测文库浓度。文库浓度达到2nM以上可用于高通量测序检测。[0059]步骤A中使用的裂解液为MZ，步骤B中使用的去蛋白液为MRD，漂洗液为RW，步骤B中使用的吸附柱miRspin、吸附柱miRelute，上述试剂及柱均来自于天根miRNA提取试剂盒。[0060]步骤C中使用的RNA3’Adapter为RA3，LigationBuffer为HML，T4RNALigase2，StopSolution为STP，5’Adapter为RA5，T4RNALigase，FirststrandbufTer，PCRmix为PML，RNAPCRPrimer为RPl，RNAPCRPrimerIndex为RPIX，上述试剂均来自于IlluminamiRNA文库构建试剂盒。[0061]值得说明的是，其它公司生产的RNA提取试剂盒及miRNA文库构建试剂盒也可用于本发明，并根据实际情况对操作细节进行相应调整。[0062]与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：[0063]一采用本方法可实现在48小时内完成对陈旧血痕miRNA文库的构建，最少仅需5cm2陈旧血痕（约含IOng-IOOngRNA样品即可。有利于对陈旧法医物证的再利用，填补了法医学领域空白，为扩展miRNA在法医学方面的应用提供有力的技术支持。[0064]二通过对陈旧血痕样品进行剪碎，增加裂解时间等预处理，能够快速实现血痕的细胞裂解。[0065]三采用天根公司生产的miRNA提取试剂盒，提取到的RNA以miRNA为主。[0066]泗）PCR扩增反应中，通过增加PCR循环数，有效提高了目的片段的含量，可将文库浓度提高10倍以上。[0067]五现有方法中切胶回收效率低，本发明通过优化切胶回收的条件，如增加裂解时间，采用自制的gelbreakertube管等，使目的片段回收更充分，回收效率可提高5倍左右。[0068]六在切胶回收步骤中将目的片段145bp左右条带回收，可有效去除大分子RNA。附图说明[0069]图1为本发明实施例1中鲜血和血痕所建miRNA文库的2100检测结果。利用本发明提供的方法所建立的血痕miRNA文库，可在150bp左右见到明显条带，与应用鲜血所建文库结果相似。而利用现有方法建立的血痕miRNA文库，只有144bp左右见到微弱条带。具体实施方式[0070]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJRussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。[0071]以下实施例中所用3’AdapterRA3、5’AdapterRA5、RNAPCRPrimerRPl、RNAPCRPrimerIndexRPIX的序列如下（SEQIDNO:1-3:[0072]3'AdapterRA3：57-rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2-37[0073]5'AdapterRA5：57-rGrUrUrCrArGrArGrUrUrCrUrArCrArGrUrCrCrGrArCrGrArUrC-37[0074]RNAPCRPrimerRPl：57-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCG-s-A-37[0075]RNAPCRPrimerIndexRPIX共12种（SEQIDNO:4-15:[0076]IndexIPrimer[0077]S7-Caagcagaagacggcatacgagatcgtgatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-S-T-37[0078]Index2Primer[0079]s^caagcagaagacggcatacgagatacatcggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-T-37[0080]Index3Primer[0081]5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-S-T-37[0082]Index4Primer[0083]S7-Caagcagaagacggcatacgagattggtcagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-S-Τ-37[0084]Index5Primer[0085]s^caagcagaagacggcatacgagatcactgtgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-Τ-37[0086]Index6Primer[0087]S7-Caagcagaagacggcatacgagatattggcgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-S-T-37[0088]Index7Primer[0089]S7-Caagcagaagacggcatacgagatgatctggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-S-T-37[0090]Index8Primer[0091]S7-Caagcagaagacggcatacgagattcaagtgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-S-T-37[0092]Index9Primer[0093]s^caagcagaagacggcatacgagatctgatcgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-T-37[0094]Index10[0095]S7-Caagcagaagacggcatacgagataagctagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-S-T-37[0096]Index11[0097]s^caagcagaagacggcatacgagatgtagccgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-s-T-37[0098]Index12[0099]S7-Caagcagaagacggcatacgagattacaaggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc-S-T-3[0100]上述序列中，r为核糖、p为磷酸，S为巯基。[0101]实施例1陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法[0102]一、miRNA提取[0103]本实施例中使用天根miRNA提取试剂盒进行miRNA提取。[0104]1.取5cm2陈旧血痕放置半年剪碎，剪碎至3-5mm2,加入200μ1体积裂解液MZ，室温静置lOmin，振荡器振荡混勾30sec〇[0105]2.室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。[0106]3.室温12,OOOrpm离心IOmin，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。[0107]4·加入200μ1氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。[0108]5.室温12,OOOrpm离心15min，样品会分成三层:黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，将水相转移到新管中，进行下一步操作。[0109]6.量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积13体积的无水乙醇如:300μ1的转移液加ΙΟΟμΙ无水乙醇），混匀此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2min，室温12，OOOrpm离心30sec，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。[0110]7.量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积23体积的无水乙醇如:300μ1的流出液加200μ1无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12，OOOrpm离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute〇[0111]8.向吸附柱miRelute中加入500μ1去蛋白液MRD请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12,000印111，离心3〇86〇，弃废液。[0112]9.向吸附柱miRelute中加入500μ1漂洗液RW请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12,000印111离心3〇86〇，弃废液。[0113]10.重复操作步骤9。[0114]11·将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12，OOOrpm约13，400Xg离心lmin，去除残余液体。[0115]12.将吸附柱miRelute加入20μ1RNAasefree水，静置15min，加入新离心管中，室温12,000rpm约13,400Xg离心5min，取滤液进行RNA浓度检测约2ngyl。-80"€保存。[0116]二、miRNA文库构建[0117]本实施例中使用IlluminamiRNA文库构建试剂盒进行miRNA文库构建。[0118]一样品起始量推荐[0119]总RNA起始量为10ng。[0120]二连接3’接头[0121]1、配制如下反应体系：[0122]RNA3’AdapterRA3Ιμΐ[0123]总RNA5μ1[0124]总体积6μ1[0125]2、充分混匀。70°C孵育2min，然后立即置于冰上。[0126]3、预热PCR仪至28°C。[0127]4、在一个新的PCR管中准备如下试剂：LigationBuiTerHML2μ1[0128]RNaseInhibitor:1μΐT4RNALigase2Ιμΐ[0129]总体积4μ1[0130]5、充分混匀。[0131]6、将步骤4得到的混匀溶液与步骤1得到的混匀溶液，充分混合。[0132]7、28°C孵育lh。[0133]8、保持PCR管在PCR仪上，加入IulStopSolutionSTP，用移液器充分混匀样品。[0134]9、28°C继续孵育15min，然后立即置于冰上。[0135]三连接5’接头[0136]1、预热PCR仪至70°C。[0137]2、将Ι.ΐμΐRNA5’AdapterRA5加至一个新的PCR管。70°C孵育2min。然后立即置于冰上待用。[0138]3、预热PCR仪至28°C。[0139]4、向管中加入Ι.ΐμΐIOmMATP，并充分混匀。[0140]5、再加入Ι.ΐμΐΤ4RNALigase，并充分混匀。[0141]6、吸取3μ1以上混合溶液至连接了3’接头的PCR管中。并充分混匀。（此时体积为14μΐ[0142]7、28°C孵育lh。然后置于冰上待用。[0143]四）反转录和PCR扩增[0144]1、稀释dNTP[0145]25mMdNTPMix0.5μ1[0146]UltraPureWater0.5μ1[0147]总体积Ιμΐ[0148]充分混合均匀，冰上待用。[0149]2、反转录过程[0150]2.1浓缩第三步中连接了5’和3’接头的产物（14μ1至6μ1。若浓缩体积过小，则加超纯水补足至6μ1。[0151]2.2向其中加入ΙμΐRNARTPrimer，充分混匀后短暂离心。[0152]2.370°C孵育2min，然后立即置冰上待用。[0153]2.4预热PCR仪至50°C。[0154]2.5在一个新的PCR管中，冰上配制如下溶液：5xFirststrandbuffer2μ1[0155]12.5mMdNTPmix0.5μ1IOOmMDTTΙμΐRNaseInhibitorIμΐ[0156]SuperscriptIlReverseTranscriptaseIμΐ总体积5:5μ1[0157]充分混匀后短暂离心。[0158]2.6将2.5中混匀溶液加入2.3中制备好的样品中（总体积12.5μ1。[0159]2.750°C孵育lh，然后立即置冰上待用。[0160]3、PCR扩增[0161]3.1制备预混液UltraPureWater8_5μIPCRmixPML25μ1[0162]RNAPCRPrimerRPl2μΙRNAPCRPrimerIndex腿X2μ1总体积375μ1[0163]充分混匀后短暂离心，冰上待用。[0164]3.2将制备的预混液加入以上反转录的PCR管中（2.7所得），总体积为50μ1。[0165]3.3按照如下条件扩增：[0166]981€3〇86。；98。：1〇86。，6〇1€3〇86。，72。：1586。，15个循环；72。：1〇11^11。4。：保持。[0167]至此可将样品保存于-20°C至多7天。[0168]五跑胶回收cDNA文库[0169]5.1准备步骤[0170]5.1.1.量取200ml5XTBEBuffer，用超纯水稀释至IXTBEBuffer工作液。[0171]5.1.2.将预制胶从4°C冰箱取出，用干净的纸巾将表面液体擦拭干净。并用marker笔标注胶孔位置及左右方向。并撕下下方白色屏蔽膜。[0172]5.1.3将处理好的预制胶放入电泳槽（白色，特制配套），卡好板子。在上层倒入少许IXTBEBuffer，观察是否漏液。如不漏液，则继续在上层补液至达到板子顶端，然后在外部补液至胶孔上方Icm左右。[0173]5.1.4在一个新的PCR管中，吸取2μ1CustomRNALadder，并加入2μ1DNALoadingDye〇[0174]5.1.5在一个新的PCR管中，吸取ΙμΐHighResolutionLadder，并加入ΙμΐDNALoadingDye〇[0175]5.1.6在扩增得到的〇0嫩文库5^1体系）中，加入1^10嫩1^»虹即〇76。[0176]5.2跑胶步骤[0177]5.2.1样品分两个孔道分别加入相邻的两个胶孔，每孔25μ1。样品不要上在两端两个胶孔内。[0178]5·2·2CustomRNALadder和HighResolutionLadder各上样2μ1,Ladder均要与样品分隔一个孔道，防止串道。[0179]5.2.3145V电泳60min。[0180]电泳时增加了50bpDNALadderMD108，购自天根公司。可有效提高切胶回收的效率。[0181]5.3染胶和切胶步骤[0182]5.3.1在一个干净容器内，加入少许IXTBEBuffer工作液，吸取少许EB原液至溶液颜色变红。室温孵育5min。[0183]5.3.2将染色完毕的胶小心移至凝胶成像仪进行切胶。切取位置为145?_16^?之间。[0184]注:胶下预先放置一个干净手套，以方便挪动位置。切胶时，切忌切胶范围过大，一般不超过IObp的浮动范围。[0185]5.4溶胶步骤[0186]5.4.1将切下的胶块放入自制的gelbreakertube利用无菌针头将0.5ml离心管底部扎小孔，面积约Imm2，10个左右小孔，各孔孔径为0.2mm，然后套入2ml离心管中）。20000g离心2min。[0187]5.4.2向2ml离心管中加入300μ1超纯水。此时0.5ml离心管中一般会有留存胶块。则将200ml枪头用剪刀剪去尖端部位，吸取下层液体移至0.5ml离心管中，将留存胶块转移至2ml离心管中。[0188]5·4·3室温roaIing过夜。中速，40转分。[0189]5.5酒精沉淀文库[0190]需要准备:预冷无水乙醇;预冷离心机。[0191]5.5.1将黄色枪头减掉尖端，以方便吸取胶块。将过夜溶解后的胶块转移至5μπιFilter。[0192]5.5.2室温600g离心30sec。[0193]5.5.3向其中加入2以1617：^611，3^131醋酸钠，975以1预冷无水乙醇，充分混匀。[0194]5.5.4立即离心，4°C，20000g离心20min。[0195]5.5.5小心去除上清，不要碰触底部pellet。如果pellet变得疏松，室温20000g再次离心2min。[0196]5.5.6加入500μ170%酒精新鲜配制），轻弹试管底部，使pellet悬浮。[0197]5.5.7室温20000g离心2min。小心去除上清，不要碰触底部pellet。[0198]5.5.8开盖晾干沉淀，可在37°：加热模块上放置5-1〇1^11至酒精完全干燥。[0199]5.5.9用10μ1IOmMTris-HClpH8.5充分溶解沉淀，并转移至PCR小管中。[0200]5.5.10将文库吸出3μ1至一个新的PCR管，供质检时备用。所有文库-80°C储存文库。[0201]5.5.11利用安捷伦Agilent2100生物分析仪检测文库片段大小，利用KAPA文库定量试剂盒检测文库浓度为5-10nM。将文库应用于IlluminaHiseq2000或FGx高通量测序。例如用SE50方法进行测序。[0202]将6例血痕样本放置半年）（5cm2利用本方法进行文库构建。将6例血痕样本放置半年）（5cm2与6例鲜血样本2〇〇μυ利用现有方法进行文库构建。[0203]结果表明利用本方法构建的血痕miRNA文库浓度为5-10ηΜ，可在150bp左右见到明显条带，可用于后续测序。但利用现有方法完全按照试剂盒说明操作仅能对鲜血样本进行miRNA文库构建，利用现有方法对血痕样本建立miRNA文库浓度过低0.05〜0.InM，只有144bp左右见到微弱条带，无法用于后续测序实验。（图1[0204]所建文库应用于Illuminahiseq高通量测序仪，应用SE50方法进行测序。应用本方法，对陈旧血痕成功进行了文库构建，所建文库经Hiseq2500单端50bp测序，测序结果见表1。该结果表明应用陈旧血痕所建文库质量与新鲜血液无显著差异。[0205]表1[0206]表1高通量测序的质量控制结果[0207][0208]其中：[0209]RawReads:下机reads[0210]CleanReads:滤过reads[0211]sequencingcoverage:测序覆盖度[0212]Thepercentageofcleanreads%:滤过reads所占比例[0213]RawBases⑹：原始数据量[0214]CleanBases⑹：滤过数据量[0215]Q20%:Q20比例[0216]Q30%;:Q30比例[0217]GCcontent%:GC比[0218]Alignmentreadsmapped%:与现有miRNA比中百分比[0219]Failedalignmentreadsunmapped%:与现有miRNA未比中百分比[0220]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A、陈旧血痕样品的预处理；B、miRNA的提取；C、miRNA测序文库的构建，步骤如下：Cl、miRNA5’和3’接头的连接；C，2、反转录；C3、PCR扩增；C4、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp大小的片段，即得测序文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A预处理的具体方法为:取5cm2陈旧血痕样品，剪碎至3_5mm2,加入200-400μ1裂解液，室温静置lOmin，然后振荡器振荡混匀30sec〇3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤B进行miRNA提取的具体方法为：B1、经预处理后的样品室温放置5min，然后室温12000rpm离心lOmin，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；B2、加入200-400μ1氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min;然后室温12000rpm离心15min，样品分层，将无色的水相转移至新管中；B3、量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积13体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRspin，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，收集流出液；B4、量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积23体积的无水乙醇，混匀后转入吸附柱miRelute，室温放置2min后，室温12000rpm离心30sec，离心后弃流出液，保留吸附柱miRelute；B5、向吸附柱miRelute中加入500-1000μ1去蛋白液，室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；B6、向吸附柱miRelute中加入500-1000μ1漂洗液，室温静置2min后，室温12000rpm离心30sec，弃流出液；B7、重复操作步骤B6;B8、将吸附柱miRelute放入收集管中，室温12000rpm离心Imin，去除残液；B9、向吸附柱miRelute中加入20_40μ1RNAasefree水，静置15min，加入新离心管中，室温12000rpm离心5min，收集流出液进行RNA浓度检测后直接用于文库构建或于-80°C保存。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤Cl具体方法如下：Cla、连接3’接头①配制如下反应体系：RNA3’AdapterΙμΐ总RNA5μ1其中，总RNA起始量为IOng;上述体系充分混匀;70°C孵育2min，然后立即置于冰上；②在一个新的PCR管中配制如下反应体系：LigationBuffer2μ1RNaseInhibitorΙμΐT4RNALigase2Ιμΐ③将步骤②的体系与步骤①得到的体系充分混合，28°C孵育Ih;向混合体系中加入ΙμΐStopSolution，混匀;继续于28°C孵育15min，然后立即置于冰上，得到3’接头连接产物；Clb、连接5’接头④将Ι.ΐμΐRNA5’Adapter加至一个新的PCR管中，70°C孵育2min，然后立即置于冰上；向管中加IOmMATPΙ.ΐμΐ，充分混匀;再加入Ι.ΐμΐT4RNALigase，充分混匀；将3μ1上述混合液加入装有11μ13’接头连接产物的PCR管中，充分混匀，然后于28°C孵育lh，然后置于冰上，得到5’和3’接头连接产物。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤C2进行反转录的具体方法为：C2a、将5’和3’接头连接产物浓缩至6μ1，向其中加入ΙμΐRNARTPrimer，充分混匀后短暂离心;70°C孵育2min，然后立即置于冰上；C2b、在一个新的PCR管中，冰上配制如下反应体系：SxFirststrandbuffer2μΙ12.5mMdNTPmix0.5ul»IOOmMDTTΙμΐRNaseInhibitor1μΐSuperscriptIIReverseTranscriptaseIμΐ上述体系充分混匀后短暂离心；将步骤C2b所得体系加入C2a的混合液中制备好的样品中，于50°C孵育lh，然后立即置于冰上。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤C3进行PCR扩增的具体方法为：制备如下预混液：UltraPureWater8.5μ1PCRmix25μIRNAPCRPrimer2μΙRNAPCRPrimerIndex2μί上述预混液充分混匀后短暂离心，将制备的预混液加入装有步骤C2所得反转录溶液的PCR管中，按照如下条件进行PCR扩增:98°C30sec;98°C10sec，60°C30sec，72°C15sec，15f循环；72°C10min。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C4的具体方法如下：C4a、PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收145-160bp大小的片段；C4b、溶胶⑤将切下的胶块0.01克放入自制的gelbreakertube管中，再将自制的gelbreakertube管放入将含有200μ1溶胶液的2ml离心管中，20000g离心2min;将200ml枪头剪去尖端部位，吸取2ml离心管中液体转移至含有300μ1超纯水的2ml离心管中；以40转分速度置于摇床上室温摇匀过夜；其中，所述自制的gelbreakertube离心管是用针头将0.5ml离心管底部扎10个孔，各孔孔径为0.2mm;所述溶胶液的制备方法为:取54gTris碱，27.5g硼酸，20ml0.5molLpH8.0EDTAdP蒸馏水至1000ml，得到储液，使用时将储液稀释10倍即为溶胶液；⑥将过夜溶解后的胶块转移至孔径为5μπι的滤管，室温600g离心30sec，然后向其中加入2μ1Glycogen，30yl3M醋酸钠，975μ1预冷无水乙醇，充分混匀，4°C，20000g离心20min，弃上清，向沉淀中加入500μ170%酒精洗涤，室温20000g离心2min，弃上清，开盖晾干沉淀，用10μ1IOmMTris-HCl溶解沉淀，所得文库经过质检，用于IlluminaHiseq2000或FGx高通量测序。8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤A中使用的裂解液为ΜΖ，步骤B中使用的去蛋白液为MRD，漂洗液为RW，步骤B中使用的吸附柱miRspin、吸附柱miRelute，上述试剂及柱均来自于天根miRNA提取试剂盒。9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤C中使用的RNA3’Adapter为RA3，LigationBuffer为HML，T4RNALigase2，StopSolution为STP，5’Adapter为RA5，T4RNALigase，Firststrandbuffer，PCRmix为PML，RNAPCRPrimer为RPl，RNAPCRPrimerIndex为RPIX，上述试剂均来自于IlluminamiRNA文库构建试剂盒。10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述5cm2陈旧血痕样品中含有的RNA总量为10ng-100ng。

百度查询： 北京市理化分析测试中心 陈旧血痕miRNA高通量测序文库的构建方法