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申请/专利权人：东北农业大学

摘要：本发明提供一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI‑QK的设计方法，其序列如序列表SEQIDNo.1所示。采用了一条α‑螺旋结构的肽KI，在其C末端连接肽QK，同时，在KI与QK之间使用了三个柔性氨基酸甘氨酸作为连接体，将此肽命名为KI‑QK。在生物学活性试验中，我们发现KI‑QK对大肠杆菌具有非常强的抑菌活性，其对大肠杆菌最小抑菌浓度的几何平均数为3.667，相比于原肽KI提高了4.2倍，治疗指数为69.812，相比于原肽提高了4.7倍。综上所述，KI‑QK是一种典型的靶向抗菌肽，对大肠杆菌具有强烈的靶向性，具有较高的应用价值。

主权项：1.一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK，其特征在于，其序列如序列表SEQIDNo.1所示。

全文数据：一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK及制备方法和应用技术领域本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK及制备方法和应用。背景技术目前，抗生素的过度使用，导致病原微生物产生耐药性，甚至造成畜禽产品中的药物残留，严重影响畜禽的健康状况、产品质量以及其安全性，从而威胁到人类的健康。抗菌肽Antimicrobialpeptides,AMPs，生物体天然免疫防御系统的重要组成部分，构成了人体免疫的第一道防线。抗菌肽的生物学特性其中一点是具有广谱抗菌性。多数抗菌肽可以杀灭包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在内的多种细菌。然而，细菌分类有益菌和致病菌，体内的有益菌如：乳酸杆菌、粪场球菌等。人类粘膜表面的正常菌群对营养吸收和保护机体抵抗外来微生物起着关键作用，而目前的抗菌肽因为具有广谱杀菌作用，会无选择性地对粘膜表面菌群中的有益菌和致病菌都有杀菌作用。正常菌群的破坏可引起粘膜表面二重感染和耐性菌株的出现，这就需要设计一类靶向抗菌肽，能选择性地杀灭正常粘膜表面菌群中的致病菌而对正常细菌无作用或作用较小，从而保持正常菌群的生态平衡。发明内容本发明的目的在于公开一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK及制备方法和应用，对大肠杆菌具有强烈的靶向性，具有较高的应用价值。本发明的目的是这样实现的：一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK，其序列如序列表SEQIDNo.1所示。本发明还具有如下技术特征1、如上所述的一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK的制备方法，如下：采用了一条α-螺旋结构的肽KI，其序列如序列表SEQIDNo.2所示，在其C末端连接肽QK，其序列如序列表SEQIDNo.3所示，同时在肽KI与肽QK之间使用了三个甘氨酸作为连接体；采用固相化学合成法得到肽KI-QK，其序列如序列表SEQIDNo.1所示，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成多肽的制备。2、如上所述的一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK在制备治疗大肠杆菌感染性疾病的药物中的应用。本发明具有如下优点及有益效果：通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现KI-QK对大肠杆菌具有非常强的抑菌活性，KI-QK在浓度为128μM时未表现出溶血活性，且对大肠杆菌的生物学活性强于原肽KI，其对大肠杆菌最小抑菌浓度的几何平均数为3.667，相比于原肽KI提高了4.2倍，治疗指数为69.812，相比于原肽提高了4.7倍。对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、表皮葡萄球菌以及益生菌植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌具有非常弱或无抑菌活性。综上所述，KI-QK是一种典型的靶向抗菌肽，对大肠杆菌具有强烈的靶向性，具有较高的应用价值。附图说明图1为抗菌肽KI的质谱图；图2为抗菌肽QK的质谱图；图3为抗菌肽KI-QK的质谱图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1抗菌肽的设计本实施例中，我们使用了一条已知的利用噬菌体展示技术筛选出来的与大肠杆菌具有强亲和力的肽QKCN103590116A，与一条具备大肠杆菌抗菌活性的α-螺旋结构肽KI相连接，从而设计出一条全新的对大肠杆菌具有强烈靶向抗菌活性的肽KI-QK。在原肽的KI的C末端连接QK抗菌肽，然后于KI和QK之间添加三个甘氨酸作为连接体，使用多肽合成仪，利用固相合成法合成上述抗菌肽。抗菌肽的氨基酸序列为：抗菌肽的序列如表1所示。表1肽的氨基酸序列KI-QK的电荷数为+10，疏水值为0.244。两段肽链以柔性氨基酸组成的连接体GlyGlyGly相连，以保证发挥正常的生物学活性。该方法使肽对大肠杆菌具有高靶向抑菌活性的同时具有较低的溶血活性，能够维持机体内微生物平衡，具有成为抗生素替代物的发展潜力。实施例2固相化学合成法合成KI-QK1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-XX是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA三氟乙酸洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS三异丙基氯硅烷按照质量比95:2.5:2.5混合而成；3、使用0.2molL硫酸钠磷酸调节至pH7.5进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合，流速为1mLmin，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA水溶液；洗脱液B为0.1％TFA乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mLmin，再同上收集主峰，冻干；4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量如图1、2所示与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。实施例3：抗菌肽生物学活性的测定1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸含0.2％BSA作为稀释液，使用倍比稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液～106个mL于各孔中。分别设置阳性对照含有菌液而不含有抗菌肽和阴性对照既不含菌液也不含肽。37℃恒温培养24-25h，用酶标仪在492nmOD492nm处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。表2抗菌肽的抑菌活性通过表2可以看出，KI-QK与原肽KI相比，其对大肠杆菌的靶向抗菌活性明显提高。2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mLPBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；lh后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起5％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果见表3。表3抗菌肽溶血活性的测定通过表3可以看出，KI-QK在浓度为128μM时未表现出溶血活性，且对大肠杆菌的生物学活性强于原肽KI，治疗指数为69.812，比原肽KI提高了4.7倍。以上结果显示，在靶向抗菌肽末端连接噬菌体展示肽，能显著提高靶向效果，同时，通过分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数溶血浓度与抑菌浓度几何平均数的比值来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性，由表3可以看出，KI-QK具有较高的治疗指数，综上表明抗菌肽KI-QK作为一种大肠杆菌的靶向抗菌肽具有替代抗生素的潜力。序列表东北农业大学一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK及制备方法和应用3SIPOSequenceListing1.0127PRTArtificialsequence1TrpLysLysIleTrpLysProGlyIleLysLysTrpIleLysGlyGly151015GlyGlnLysArgProArgValArgLeuSerAla2025214PRTArtificialsequence2TrpLysLysIleTrpLysProGlyIleLysLysTrpIleLys1510310PRTArtificialsequence3GlnLysArgProArgValArgLeuSerAla1510

权利要求：1.一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK，其特征在于，其序列如序列表SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK的制备方法，其特征在于，方法如下：采用一条α-螺旋结构的肽KI，肽KI序列如序列表SEQIDNo.2所示，在其C末端连接肽QK，肽QK序列如序列表SEQIDNo.3所示，同时在肽KI与肽QK之间使用了三个甘氨酸作为连接体；采用固相化学合成法得到肽KI-QK，其序列如序列表SEQIDNo.1所示，经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，完成多肽的制备。3.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌靶向抗菌肽KI-QK在制备治疗大肠杆菌感染性疾病的药物中的应用。

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