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申请/专利权人：河北科技师范学院

摘要：本发明公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA在亚单位疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，具体包括：以迟缓爱德华菌ET‑CL基因组序列为模板，PCR扩增ompA基因；构建pMD18‑T‑ompA载体，对ompA基因进行序列测定；构建重组表达载体pET‑32a‑ompA；将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆，提取质粒，测序；进行重组蛋白的原核表达；利用SDS‑PAGE分析重组蛋白表达情况；对重组蛋白进行Westernblot验证。本发明利用原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的重组蛋白，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，表明该重组蛋白能够用于研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点。

主权项：1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白OmpA在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述亚单位疫苗的制备方法如下：（1）以迟缓爱德华菌ET-1基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增ompA基因；其中引物P1和P2为：P1：5’-ATGAAAAAAACAGCGATCGCA-3’SEQIDNO：1；P2：5’-TTAAGCCTGCGGCTGAGAAACTTC-3’SEQIDNO：2；（2）构建pMD18-T-ompA载体，对ompA基因进行序列测定；（3）测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，以pMD18-T-ompA为模板，P3和P4为引物，PCR扩增ompA基因，获得纯化目的基因；其中引物P3和P4为：P3：5’-GGAATTCGCTCCGAAAGATAACACCTGG-3’，EcoRⅠ；SEQIDNO：3；P4：5’-ACGCGTCGACAGCCTGCGGCTGAGTAACTTC-3’，SalⅠ；SEQIDNO：4；（4）利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对纯化目的基因和pET-32a载体分别进行双酶切，构建重组表达载体pET-32a-ompA；（5）将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；（6）将重组表达载体pET-32a-ompA和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌，进行重组蛋白的原核表达；（7）利用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况；（8）对重组蛋白进行Westernblot验证；（9）利用尿素提取法对包涵体进行纯化，将超声裂解后的沉淀物按每克溶于1mL水中，4℃高速离心15min；将沉淀重悬于1mL含有1M尿素的0.1molLpH8.5的Tris-Cl，4℃高速离心15min；取上清获得较为纯净的目的蛋白OmpA；（10）将步骤（9）获得的目的蛋白OmpA用弗氏完全佐剂乳化，获得亚单位疫苗；步骤（6）所述转化BL21工程菌的具体步骤如下：分别将5μL重组载体pET-32a-ompA和5μL空载体pET-32a加入到100μLBL21工程菌中；冰浴30min，42℃热浴90s，冰浴5min；加入1mL液体LB培养基，37℃复壮1h后，各取5μL涂布于氨苄终浓度为100μgmL的固体LB平板，倒置，37℃培养过夜。

全文数据：一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA技术领域[0001]本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA。背景技术[0002]迟缓爱德华菌Edwardsiellatarda，E.tarda是水产养殖中十分常见的病原细菌之一，能够引起多种海水和淡水鱼类感染发病，造成高死亡率、系统感染和败血症，鱼群整体免疫力下降，严重影响水产养殖发展。目前，E.tarda已经成为我国鱗、解、鳗鱼类的最重要病原之一，给水产养殖造成重大损失。除此之外，E•tarda可以引起人的多种类型感染，严重可致败血症，危及生命，因此对本菌的研究具有重要的公共卫生学意义。[0003]畜禽养殖上疫苗广泛使用对疫病的防控效果良好，为水产疫病防控提供了借鉴。对于E.tarda而言，基于保护性抗原筛选研宄的亚单位疫苗和活载体疫苗研宄成为研究的热点。研究表明，外膜蛋白（outermembraneproteins，0mps具有优良的免疫原性，能够诱导机体产生非常强的免疫反应，利用外膜蛋白粗提物免疫动物展现出非常好的保护效果。本发明利用原核表达系统对外膜蛋白主要成分OmpAouter-membraneproteinA进行表达和纯化，通过动物实验评估该重组蛋白对于模型动物的保护力，表明该重组蛋白能够用于研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA，具体通过原核表达方法，获得迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA重组蛋白，从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0006]具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA在亚单位疫苗中的应用。[0007]进一步，所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的制备方法，具体步骤如下：[0008]1以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增ompA基因；PCR扩增的反应体系为20nL，其中2XTaqPCRMix10uL，引物Pl20uM和P220uM各luL，模板lyL，ddH207yL，PCR扩增的反应程序为94。：预变性5min，94°C3〇s，54°C3〇s，72°C6〇s，25个循环，72°C10min;其中引物P1和P2为：[0009]P1:5’-ATGAAAAAAACAGCGATCGCA-3’；SEQIDNO:1;[0010]P2:5,-TTAAGCCTGCGGCTGAGAMCTTC-3’；SEQIDN0:2;[0011]2构建pMD18-T-〇mpA载体，对ompA基因进行序列测定；[0012]⑶测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，以pMD18-T-ompA为模板，P320uM和P420uM为引物，PCR扩增ompA基因，获得纯化目的基因；PCR扩增的反应体系为20uL，其中2XTaqPCRMix10uL，引物P3和P4各1此，模板lyL，ddH2〇7uL，PCR扩增的反应程序为94°C预变性5111丨11，94°〇3〇3,53。〇3〇3,72。〇6〇3,30个循环，72°：1〇111111;其中引物?3和卩4为：[0013]4P3:5,-GGAATTCGCTCCGAAAGACGACACCTGG-3,，EcoRI;SEQIDNO:3;[0014]5P4:5’-ACGCGTCGACAGCCTGCGGCTGAGAAACTTC-3,，SalI;SEQIDNO:4;[0015]其中下划线部分为酶切位点；[0016]⑹利用限制性内切酶EcoRI和Sail对纯化目的基因和pET_32a载体分别进行双酶切，构建重组表达载体pET-32a-〇mpA;[0017]7将重组表达载体转化DH5a感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；[0018]8将重组表达载体pET-32a-ompA和空载体pET_32a分别转化BL21工程菌，进行重组蛋白的原核表达；[0019]⑼利用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况；[0020]10以His-Mab为一抗、HRP-IgG为二抗，对重组蛋白进行Westernblot验证。[0021]本发明的有益效果是:本发明利用原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的重组蛋白，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点。附图说明：[0022]图1为本发明实施例1中不同菌株ompA基因同源性分析；[0023]图2为本发明实施例2中ompA基因的PCR扩增；[0024]M.DL2000plusMarker;1.ompA基因扩增；[0025]图3为本发明实施例4中SDS-PAGE分析重组蛋白在大肠杆菌中的表达；[0026]M.蛋白Marker;1.pET-32a-〇mpABL21菌体裂解物;2.pET-32aBL21空载对照；[0027]图4为本发明实施例4中Westernblot分析His-〇mpA在大肠杆菌中的表达；[0028]1.pET-32a-ompABL21菌体裂解物;2•pET-32aBL21空载对照；[0029]图5为本发明实施例4中重组蛋白的可溶性分析；[0030]M.蛋白Marker;1.pET-32a-〇mpABL21菌体裂解物；[0031]2.pET-32a-〇mpABL21菌体裂解物上清;3•pET-32a-〇mpABL21菌体裂解物沉淀；[0032]图6为本发明实施例4中纯化的目的蛋白的SDS-PAGE;[0033]M•蛋白Marker;1.pET-32a-〇mpABL21菌体裂解物沉淀;2•纯化重组蛋白；[0034]图7为本发明实施例4中Westernblot分析阳性血清对重组蛋白的识别；[0035]1.重组蛋白；2.阴性对照His-〇C呼肠孤病毒衣壳蛋白）；[0036]图8为本发明实施例5中重组蛋白对小鼠的免疫保护效果；[0037]图9为本发明实施例5中免疫小鼠血清的抗体水平变化。具体实施方式[0038]以下结合附图对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[°039]实施例1迟缓爱德华菌ompA基因序列分析[0040]根据GenBank上登录的E.tarda参考菌株ET-1基因组序列（CP001135.1ompA基因设计引物，引物P1和P2为：[0041]Pl:5,-ATGAAAAAAACAGCGATCGCA-3,；SEQIDN0:1;[0042]P2:5’-TTAAGCCTGCGGCTGAGAAACTTC-3’；SEQIDNO:2;[0043]利用细菌基因组提取试剂盒提取ET-CL基因组，并以其为模板PCR扩增ompA基因；其中PCR扩增的反应体系为20此，其中2XTaqPCRMix10此，引物Pl20yM和P220yM各1UL，模板lyL，ddH207yL;PCR扩增反应程序：94°C预变性5min，94°C30s，54°C30s，72°C60s，25个循环，72°C10min;回收目的基因，连接pMD18-T载体，10yL体系：目的基因4.5此41©18-TVector0.5yL，2XConnectbuffer5yL，16°C连接过夜；连接产物转化入DH5a感受态细胞;挑取单菌落进行PCR检测，由生工生物公司进行序列测定，参照GenBank中E•tarda参考菌株及其它肠杆菌科细菌ompA基因序列对测序结果进行比对分析，结果如图1所示，爱德华菌属成员间ompA基因高度保守，且与气单胞菌属同源性较高。[0044]实施例2迟缓爱德华菌ompA基因扩增[0045]利用UniProt网站分析E.tarda的OmpA蛋白基本结构特性，根据测序结果设计特异性扩增引物P3和P4,去除OmpA信号肽部分，OmpA蛋白信号肽影响蛋白表达。[0046]将实施例1测序结果正确的PMD18-T-〇mpA菌株扩大培养，提取质粒，并以其为模板，P320_*P420yM为引物，PCR扩增ompA基因，获得大小为990bp的目的片段如图2所示），纯化目的基因；其中PCR扩增的反应体系为20此，其中2XTaqPCRMix10uL，引物P3和P4各1此，模板lyL，ddH207yL，PCR扩增的反应程序为94°C预变性5min，94°C30s，53°C30s，72°C60s，30个循环，72°C1Omin;其中引物P3和P4为：[0047]P3:5,-GGAATTCGCTCCGAAAGACGACACCTGG-3,,EcoRI；SEQIDNO：3；[0048]P4:5,-ACGCGTCGACAGCCTGCGGCTGAGAAACTTC-3,，SalI;SEQIDNO:4;[0049]其中，下划线部分为酶切位点。[0050]实施例3pET-32a-〇mpA重组表达载体的构建[0051]利用EcoRI和SalI分别对纯化目的基因和PET-32a载体进行双酶切，构建重组表达质粒pET-32a-〇mpA，转化DH5a感受态细胞，冰浴30min，42°C热浴90s，冰浴5min;加入lmLLB液体培养基，37°C复壮lh，涂布于含有氨苄终浓度为100ugmL的平板，倒置于37°C培养过夜;挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，双酶切体系共30uL:重组质粒pET-32a25uL，EcoRISalI限制性内切酶各luL，10XGreenBuffer3uL，37°Clh，阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码。[0052]实施例4重组蛋白的原核表达[0053]将重组载体pET-32a-〇mpA和空载体分别转化入BL21工程菌中，冰浴30min，42°C热浴90s，冰浴5min;加入lmLLB液体培养基，37°C复壮lh，涂布于含有氨苄终浓度为100ugmL的平板，倒置于37°C培养过夜。挑取单菌落接种于含有100ugL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37°C震荡培养至0D_值为0•6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mmolL，37°C震荡培养4h〜6h，离心收集菌体，PBS缓冲液洗涤3次;加入蛋白上样缓冲液，充分混匀后煮沸lOmin，离心，收集上清液即为菌体裂解物。[0054]利用SDS-PAGE鉴定，上样后，电压调至80V，待样品通过分离胶与浓缩胶分隔线后，将电压调至120V，至电泳结束，取出胶片考马斯亮蓝染色lmin，用蒸馏水多次煮沸脱色;结果如图3所示，在58kD处出现目的蛋白条带。[0055]用Westernblot方法进一步确认目的蛋白表达。SDS-PAG电泳后，取出胶片，利用转膜仪将蛋白转至NC膜上80Vlh;转膜结束后，取出NC膜，PBST洗涤3次，5min次;5%脱脂奶粉室温封闭lh，PBST洗涤3次，5min次；用5%脱脂奶粉按1:1〇〇〇稀释HiS-Mab作为一抗，室温孵育lh;PBST洗涤3次，5min次;5%脱脂奶粉按1:5000稀释HRP-IgG作为二抗，室温孵育30min;PBST洗涤3次，5min次;加入显影液，避光5min，最后发光显影;结果如图4所示，进一步验证表明重组蛋白OmpA成功表达。[0056]离心收集菌体，加入蛋白上样缓冲液，置于冰盒内超声20min，超声3s，暂停3s;裂解后离心，收集上清和沉淀;进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，重组蛋白主要存在于沉淀中，以包涵体形式表达。[0057]利用尿素提取法对包涵体进行纯化，将超声裂解后的沉淀物按每克（湿重）溶于lmL水中，4°C高速离心15min;将沉淀重悬与lmL含有1M尿素的0•lmolLTris-ClpH8.5，4。:高速离心15min;取上清获得较为纯净的目的蛋白，结果如图6所示，测定蛋白浓度为0•56mgmL〇[0058]以E.tarda感染小鼠阳性血清（1:100为一抗，HRP-IgG1:5000为二抗，利用Westernblot验证阳性血清对重组蛋白的识别，结果如图7所示，E.tarda感染小鼠阳性血清可以特异性识别重组OmpA蛋白。[0059]实施例5重组蛋白免疫保护实验[0060]随机将40只健康昆明鼠随机分成两组，每组20只。首免肌肉注射30yg重组蛋白OmpA弗氏完全佐剂乳化），间隔2周后二免弗氏不完全佐剂乳化），30d后以弗氏不完全佐剂乳化蛋白加强免疫;对照组注射等体积PBS对应弗氏佐剂乳化）。第48d对两组小鼠腹腔接种5LD5。2•0X107Cfu迟缓爱德华菌ET-CL菌液，感染后观察4d，统计死亡数量。结果显示，对照组小鼠全部死亡，免疫组小鼠9只死亡，其余小鼠在经历短暂精神沉郁、不食后逐渐恢复健康。结果如图8所不，表明重组蛋白OmpA免疫小鼠后具有一定保护力，保护率为55%。[0061]在小鼠免疫前后不同时间点，以眶下窦采取小鼠血液并分离血清，以超声破碎的迟缓爱德华菌全菌蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体的效价，以阴性血清〇D45q平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准，计算出临界值为0.160,当待检血清㈤值大于临界值时判定为阳性;当待检血清〇D值小于临界值时判定为阴性。将4次采集的血清进行间接ELISA检测，结果如图9所示，表明重组蛋白免疫小鼠能够产生较高水平特异性抗体，在加强免疫后达到最高水平。[0062]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白在亚单位疫苗中的应用。、2.根据权利要求1所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白〇1111：八的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：1以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增〇mpA基因；其中引物P1和P2为：Pl:5’-ATGAAAAMACAGCGATCGCA-3’SEQIDN0:1;P2:5,-TTMGCCTGCGGCTGAGMACTTC-3’SEQIDN0:2;⑵构建pMD18-T-ompA载体，对ompA基因进行序列测定；⑶测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，以PMD18—模板，P_P4为引物，PCR扩增ompA基因，获得纯化目的基因；其中引物P3和P4为：P3:5,-GGAATTCGCTCCGAAAGACGACACCTGG-3’,EcoRI；SEQIDNO：3；P4:5’-ACGCGTCGACAGCCTGCGGCTGAGAAACTTC-3’，Sail;SEQIDNO:4;⑷利用限制性内切酶EcoRI和311对纯化目的基因和口61'-328载体分别进行双酶切，构建重组表达载体pET-32a-ompA;5将重组表达载体转化DH5a感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；_6将重组表达载体pET-32a-〇mpA和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌，进行重组蛋白的原核表达；7利用SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况；⑻对重组蛋白进行Westernblot验证。3.根据权利要求2所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白〇mpA的原核表达方法，其特征在于，步骤⑴所述PCR扩增的反应体系为20此，其中2XTaqPCRMix10此，2〇uMPllyL，20yMP21UL，模板lyL，ddH207yL，PCR扩增的反应程序为94°C预变性5min，94°C3〇3,54。03〇3,72。〇6〇3,25个循环，72。：1〇111111。4.根据权利要求2所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的原核表达方法，其特征在于，步骤⑶所述PCR扩增的反应体系为20此，其中2XTaqPCRMix10uL，20uMP31iiL，20uMP41yL，模板lyL，ddH207yL，PCR扩增的反应程序为94°C预变性5min，94°C3^，53。〇3〇8,721：6〇8,30个循环，72。：1〇11^11。5.根据权利要求2所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的原核表达方法，其特征在于，步骤⑹所述转化BL21工程菌的具体步骤如下：分别将5uL重组载体pET-32a-〇mpA和5此空载体pET-32a加入到lOOyLBL21工程菌中；冰浴30min，42°C热浴90s，冰浴5min;加入lmL液体LB培养基，37。：复壮lh后，各取5uL涂布于氨苄终浓度为l〇〇UgmL的固体LB平板，倒置，37°C培养过夜。6.根据权利要求2所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白OmpA的原核表达方法，其特征在于，步骤⑻所述Westernblot验证以His-Mab为一抗、HRP_IgG为二抗。

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