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申请/专利权人：杭州联科生物技术股份有限公司

摘要：本发明公开了一种藻红蛋白PE与AnnexinV蛋白偶联方法，包括以下步骤：步骤1：AnnexinV蛋白表达纯化：1.1：基因序列优化：查找人AnnexinV蛋白的基因序列，将人AnnexinV基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体pET28a上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；1.2：AnnexinV蛋白诱导表达：挑取pET28a‑AnnexinV质粒单菌落，接种到10ml含有50μgml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜，按照1：100将培养的菌液接种到含50μgml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液浓度OD600为04‑0.6；本发明先通过分子筛纯化去除大部分游离的PE后再采用镍柱纯化浓缩，得到纯度较高的AnnexinV‑PE标记物，且保持蛋白良好的生物活性，可用于细胞凋亡检测。

主权项：1.一种藻红蛋白PE与AnnexinV蛋白偶联方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：AnnexinV蛋白表达纯化：1.1：基因序列优化：查找人AnnexinV蛋白的基因序列，将人AnnexinV基因序列优化，去除终止密码子序列，将其连入原核表达载体pET28a上，保留前后His标签蛋白，为蛋白纯化及后续偶联荧光素纯化做准备；1.2：AnnexinV蛋白诱导表达：挑取pET28a-AnnexinV质粒单菌落，接种到10ml含有50μgml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜，按照1：100将培养的菌液接种到含50μgml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液浓度OD600为04-0.6，取出1ml菌液作为未诱导，剩余菌液加入IPTG至终浓度0.5mM，置于恒温摇床中，于28℃、150rpmmin诱导6h；1.3：AnnexinV蛋白菌液破碎：将收集的菌液离心，PBS清洗两遍，加入超声裂解液20mMNaH2PO4，300mMNaCl，pH7.4重悬菌体，加入终浓度500μgml溶菌酶和1mMPMSF，混匀后，冰上孵育15min，冰上超声破碎仪破碎处理，超声结束后，4℃，12000rpm离心20min，收集上清溶液进行纯化；1.4：AnnexinV蛋白纯化：采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化表达的AnnexinV蛋白，用平衡缓冲液20mMNaH2PO4，300mMNaCl，20mM咪唑，pH7.4平衡层析柱，将AnnexinV总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mM咪唑，pH7.4进行洗脱，分管收集，SDS-PAGE鉴定每管蛋白纯度，合并纯度大于90％蛋白，用PBS缓冲液，10kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后AnnexinV蛋白，BCA法对蛋白定量；步骤2：藻红蛋白PE巯基化：取5mgPE溶液于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，弃上清，加入0.1MPB重悬沉淀，pH7.2，利用脱盐柱对PE脱盐处理，脱盐后调整浓度为10mgml，3-2-吡啶二巯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯SPDP溶解于DMSO中配制30mgml母液，按照PE与SPDP摩尔比1:30加入SPDP母液，轻轻混匀，用铝箔纸封好反应混合物，室温振荡孵育2小时，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SPDP小分子，脱盐后的PE-SPDP溶液中加入DTT至终浓度50mM，轻轻混匀后，室温静止反应30min，反应结束后用脱盐柱脱盐除去游离DTT；表达载体步骤3：AnnexinV蛋白衍生化：取1mgAnnexinV蛋白溶液5mgml于1.5ml离心管中，将琥珀酰亚胺-4-N-甲基马来酰亚胺环己烷-1-碳酸酯SMCC溶解于DMSO中配制30mgml母液，按照AnnexinV与SMCC摩尔比1:30加入SMCC母液，轻轻混匀，室温振荡孵育2小时，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SMCC小分子；步骤4：PE-SPDP与AnnexinV-SMCC共价偶联：按照PE-SPDP与AnnexinV-SMCC摩尔比1:1混合后，室温振荡孵育2h，孵育结束后每mg蛋白加入5μlN-乙基马来酰胺NEM，室温振荡孵育30min，终止反应；步骤5：偶联产物纯化：先采用AKTA蛋白纯化仪进行纯化，纯化柱型号HiLoad16600Superdex200pg，流动相1×PBS，pH7.4，检测波长280nm，洗脱顺序依次为AnnexinV-PE、游离的PE、游离的AnnexinV，由于藻红蛋白PE易于轴向扩散，导致分离纯化的AnnexinV-PE中有少量的游离的PE，所以将收集洗脱的AnnexinV-PE进一步采用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化浓缩上述收集的AnnexinV-PE，用平衡缓冲液20mMNaH2PO4，300mMNaCl，20mM咪唑，pH7.4平衡层析柱，将上述收集的AnnexinV-PE总蛋白上柱，用平衡缓冲液洗去未结合蛋白，加入洗脱缓冲液20mMNaH2PO4，300mMNaCl，250mM咪唑，pH7.4进行洗脱，分管收集，流式染色鉴定每管收集蛋白是否具有凋亡检测活性，合并具有凋亡检测活性蛋白，用1×PBS缓冲液，50kD的透析袋进行透析过夜，收集透析后偶联产物AnnexinV-PE；步骤6：偶联产物检测细胞凋亡：6.1：集0.5-1×106个HL60细胞，离心洗涤两次，弃上清；6.2：用500μl阳性质控液重悬细胞，置冰上孵育30分钟；6.3：用预冷PBS离心洗涤，弃上清；6.4：加入适量预冷1×BindingBuffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混匀，加入预冷1×BindingBuffer补充至1.5ml，等分三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管；6.5：单染管分别加入5μlAnnexinV-PE，室温避光孵育10分钟。

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