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申请/专利权人：温州医科大学

摘要：本发明涉及一种Thp‑1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫AngiostrongylusCantonensis，Ac蛋白Galectin‑1诱导凋亡中的应用。本发明为一种Thp‑1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin‑1诱导凋亡中的应用，该应用为研究广州管圆线虫致病机制以及防治的应用，为广州管圆线虫病的治疗提供理论依据，为治疗药物的研制提供潜在作用靶点，即AnnexinA2；同时为广州管圆线虫病治疗药物的研发奠定基础，为广州管圆线虫的个性化治疗提供靶标，具相当的市场前景和应用性。

主权项：1.一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1体外诱导Thp-1细胞凋亡中的应用，其特征在于：所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导Thp-1细胞凋亡。

全文数据：Thp-1细胞膜蛋白AnnexinA2在Ac-Gal-1诱导凋亡中的应用技术领域本发明属于生命科学技术领域，尤其是一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫AngiostrongylusCantonensis，Ac蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。背景技术广州管圆线虫AngiostrongylusCantonensis是引起嗜酸性脑膜炎的重要病原体，可引起中枢神经系统损伤，严重者导致死亡。Galectins在诱导细胞凋亡方面发挥重要作用，但尚无广州管圆线虫Galectin-1具有诱导细胞凋亡功能的研究和应用，以及诱导细胞凋亡的膜蛋白受体。通过检索，与本发明专利申请相似的现有研究如下：1人类Galectins蛋白具有诱导细胞凋亡的功能。2广州管圆线虫Galectin-1是一种重要的免疫调节分子，具有免疫抑制作用。通过对比，本发明专利申请与上述相关的公开文献存在本质的不同。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，补充对广州管圆线虫致病机制研究的不足，提供一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，该应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡的应用，特别是Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在细胞凋亡过程中可作为药物靶点的应用，为治疗药物的研制提供新思路，为广州管圆线虫病的治疗提供理论依据。本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。而且，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1通过细胞膜蛋白AnnexinA2诱导Thp-1细胞凋亡的应用。而且，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1在诱导细胞凋亡以及广州管圆线虫致病机制中的应用。而且，所述应用为Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导的细胞凋亡中作为治疗广州管圆线虫的药物靶点中的应用。而且，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用。而且，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具体操作步骤如下：①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μgmLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、18h、24h；②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；③在细胞培养箱内继续孵育2h；④在450nm处测定吸光度；⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞凋亡为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用AnnexinV-FITCPI双染色结合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；根据CCK-8结果，选择500ngmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1蛋白作用浓度，进行流式检测；同等浓度的牛血清白蛋白处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地塞米松处理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞凋亡率显著增高；具体操作步骤如下：①将0.5μgmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；②细胞消化下来后，加入细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μL结合液，轻轻重悬细胞；④加入5μL结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；⑤室温20～25℃避光孵育10min；⑥随即进行流式细胞仪检测，结合液为绿色荧光，PI为红色荧光；⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，WesternBlot检测促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理组、同等浓度的牛血清白蛋白处理组作为无关蛋白对照；与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降低；具体步骤如下：①样品制备100μgmLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴壁细胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每107个细胞加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，13000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；操作步骤如下：①测定pNA标准曲线：标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀释液；将pNA10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；②样品的收集吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g4℃离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；③样品测定如下设置反应体系：空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL取出Ac-DEVD-pNA2mM，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA2mM后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；③将细胞重新悬浮在2mLHomogenizationBuffer中，在冰上用匀浆细胞30-50次；④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并弃去沉淀；⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋白质膜；⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互作蛋白；操作步骤如下：①贴壁细胞裂解液的制备弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mL细胞裂解Buffer于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分接触；4℃，12000×g离心10min，收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；②取细胞裂解液350μL加入350μL2×IPBuffer；③将样品加入到His标签蛋白磁珠复合物中，室温孵育10min；④孵育完成后将离心管放入磁力架1min，弃去上清；⑤用300μL1×BindingWashBuffer清洗磁珠4次，加入1×BindingWashBuffer后混匀放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白复合物可用于后续分析；⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，观察电泳结果；⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE质谱鉴定；⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——免疫荧光荧光共定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与AnnexinA2可能存在相互作用：①将圆形细胞爬片加到24孔板；②将1mL含有PMA的THP-1细胞悬液滴加在爬片上，37℃培养48h，使细胞贴在爬片上，伸出伪足诱导成为贴壁细胞；③吸去上清，用37℃水浴锅预温的PBST洗涤1次，每孔加入1mL；④质量百分数为4％的多聚甲醛37℃固定细胞15min；⑤用预温的PBS静置洗涤3次，用注射器吸去；⑥质量百分数为10％的FBS37℃封闭30min，吸去FBS；⑦一抗抗体用质量百分数10％FBS稀释，放在37℃培养箱里3h，或4℃过夜；⑧用预温的PBST洗5次；⑨加用质量百分数10％FBS稀释后的HRP山羊抗兔二抗，45min，从该步起均闭光；⑩每孔加400μLDAPI染细胞核4min，预温的PBST洗5次；质量百分数为50％的甘油封片：在载玻片上加一滴质量百分数为50％甘油，然后把载玻片正面扣在甘油上，激光共聚焦显微镜镜下观察；⑻Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验按照步骤⑹的IP实验的操作步骤操作，进行IP实验即可；根据QE质谱鉴定及免疫荧光实验验证Thp-1细胞膜上的AnnexinA2可能是Ac-GaIectin-1结合作用到Thp-1细胞膜上的配体，用WesternBlot验证；⑼Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——Co-IP免疫共沉淀为了进一步证明AnnexinA2与Ac-Galectin-1相互结合，采用Co-IP免疫共沉淀方法进行验证：①抗体固定化将偶联树脂平衡至室温，用ddH2O稀释交联缓冲液至1×，轻轻摇晃偶联树脂使其重悬，使用大枪头吸取50μL均一偶联树脂至离心柱中，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min，弃流出液；用200μL1×交联缓冲液洗涤树脂，1000g离心1min并弃流出液，用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，然后插入底塞；向离心柱中加入50μg抗体，用ddH2O和20×交联缓冲液将液体体积调整至200μL；在通风厨中，吸取3μL5M氰基硼氢化钠溶液加入到200μL反应体系中；离心柱在室温条件下旋转孵育2h；离心并加入200μL1×交联缓冲液洗一次；加入200μL淬灭缓冲液，1000g离心1min，再在通风橱中加入3μL氰基硼氢化钠溶液，盖上旋盖上下颠倒轻轻混匀，室温孵育15min；卸下底塞，1000g离心1min并弃流出液，加入200μL1×交联缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复上述操作一次；加入150μL洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复六次；②哺乳动物细胞裂解胰酶消化贴壁细胞，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入1mL杜氏PBS轻悬细胞，2000rpm离心5min重复2次，获得细胞沉淀；将冰上预冷的IP裂解洗涤缓冲液加入细胞沉淀中，随后立即加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，放置冰上孵育裂解10min并充分混匀；～13000g，4℃离心10min以沉淀细胞碎片，离心后吸取上清转移到新EP管中，进行BCA法蛋白定量；③对照琼脂糖预处理细胞裂解液加入100μL1×交联缓冲液，1000g离心1min，弃流出液；轻轻重悬对照琼脂糖树脂使其均匀，对于1mg细胞裂解液中加入80μL对照琼脂糖树脂到离心柱中；4℃冰箱中旋转孵育1h，1000g离心1min，保留流出液；④免疫共沉淀加入200μLIP裂解洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液；重复该操作一次；用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，随后加入对照琼脂糖预处理过的细胞裂解液，4℃冰箱中旋转孵育过夜；去掉底塞，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min并保留流出液做后续分析；加入200μLIP裂解洗涤缓冲液并离心，该步骤重复两次；加入100μL1×条件缓冲液并离心，保留流出液，BCA检测蛋白浓度；⑤洗脱将离心柱置于一个新的离心管中，加入10μL洗脱缓冲液，1000g离心1min，加入50μL洗脱缓冲液，室温条件下静置5min，1000g离心1min，保留洗脱液并记作E1；可再次洗脱，洗脱液分别记作E2、E3；⑥将免疫共沉淀的洗脱液取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制备样品；进行WesternBlot验证，操作步骤均按照上述步骤⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达方法，采用的一抗二抗也均与步骤⑹的IP实验时一致；⑽Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——MAPK通路磷酸化蛋白芯片预实验确定通路磷酸化的时间点，用100μgmLAc-Galectin-1分别作用于Thp-1细胞0h，0.5h，1h，2h；收集细胞沉淀，RIPA裂解，加入磷酸酶抑制剂NaVO3，取RIPA裂解液40μL，加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；进行WesternBlot验证，孵育一抗Anti-phosphotyrisinerabbitpAb过夜，4℃，室温孵育抗兔二抗1h后进行曝光，成像仪成像，观察结果；筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白；①将2.0mL洗膜缓冲液TBST加入要使用的4孔多碟的每个孔中，将膜片单张放置在4孔多碟的一个孔中，摇动平台摇床上孵育1h；②当膜被封闭好后，准备样品，即未处理组Thp-1细胞裂解液和Ac-Galectin-1处理组细胞裂解液，每个样品取400μL加入样品分离管，使用缓冲液调节至1.5mL的最终体积；③向每个制备的样品中加入20μL检测抗体混合物，在室温下孵育混合1h；④从4孔多碟的孔中吸去TBST缓冲液并添加制备的样品抗体混合物，盖上4孔多碟，在摇床摇床上2-8℃孵育过夜；⑤在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑥吸取2mL1×链霉亲和素-HRP到4孔多碟的每个孔中，在室温下摇动平台摇床上孵育30min，在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑦小心地从洗涤容器中取出每个膜，每个薄膜上带有标识数字的面朝上放置，将1mL制备的Chemi试剂均匀地吸移到每个膜上；⑧成像仪曝光膜1-10min；⑾Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——WesternBlot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达①样品制备在对Thp-1细胞处理之前，先去掉含有胎牛血清的培养液，用不含胎牛血清的1640培养液使细胞饥饿12h后，特异性c-JUN抑制剂作用于细胞20min，即可达到抑制JNK磷酸化的效果，再加入100μgmlAc-Galectin-1细胞作用1h，同时10ngmlEGFR刺激Thp-1细胞，激活通路，作为阳性对照；弃去培养液，用刮铲刮下细胞，1500rpm离心l0min，收集细胞，PBS洗涤一次；每加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，2000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入l0μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；分组：空白对照组、10μMSP600125处理组、10μMSP600125+100μMAc-Galectin-1处理组、100μMAc-Galectin-1处理组、10μMEGFR处理组；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果。而且，所述步骤⑴CCK-8结果显示，在0-2μgmL作用浓度下细胞活性抑制率成指数增长，趋势尤为显著，因此步骤⑵中采用广州管圆线虫Galectin-1的诱导浓度为500ngmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmL。而且，所述步骤⑴中采用碧云天试剂公司的CCK-8检测试剂盒；或者，所述步骤⑵中采用南京建成试剂公司的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡；或者，所述步骤⑵中采用Gibco胰酶，用于消化细胞；所述步骤⑵中细胞培养液为1640细胞培养液，所述结合液为AnnexinV-FITC结合液；而且，所述步⑶⑾中采用CST单克隆一抗及二抗检测GAPDH、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、JNK、ERK、Akt、EGFR、AnnexinA2蛋白表达及磷酸化水平；或者，所述步骤⑷中采用碧云天碧云天试剂公司的caspase-3活性检测试剂盒；或者，所述步骤⑸采用Biovision细胞膜蛋白提取试剂盒。或者，所述步骤⑹⑻中采用SinoBiologicalIncHis-IP试剂盒。而且，所述步骤⑼中采用Pierce免疫共沉淀Co-IP试剂盒；或者，所述步骤⑼①中偶联树脂为加强型Amino-Link偶联树脂；或者，所述步骤⑽中筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白采用人MAPK通路磷酸化蛋白芯片试剂盒；或者，所述步骤⑽①中TBST配方为：8gNaCl、20mL1MTris-HClPH＝8.0，加入去离子水定容至1L再加入500μL吐温；或者，所述步骤⑾①中特异性c-JUN抑制剂采用Selleck特异性JNK磷酸化抑制剂SP600125。本发明取得的优点和积极效果是：1、本发明为广州管圆线虫蛋白Galectin-1以及与其相互作用的细胞膜蛋白AnnexinA2的应用，该应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有使细胞发生凋亡的作用的应用，特别是一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，该应用为研究广州管圆线虫致病机制以及防治的应用，为广州管圆线虫病的治疗提供理论依据，为治疗药物的研制提供潜在作用靶点；同时为广州管圆线虫病治疗药物的研发奠定基础，为广州管圆线虫的个性化治疗提供靶标，具相当的市场前景和应用性。2、本发明中广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有诱导Thp-1细胞凋亡作用的验证方法简单、操作方便，分析了广州管圆线虫Galectin-1蛋白对Thp-1细胞有凋亡作用，筛选出于Galectin-1相互作用并引发细胞凋亡的细胞膜受体AnnexinA2蛋白，并进一步通过验证，从不同方面分析了广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡的信号通路相关蛋白，为更好地理解广州管圆线虫的致病机制提供依据，为广州管圆线虫病的免疫治疗奠定理论基础。附图说明图1-A-E为本发明中CCK-8检测分别检测不同时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μgmlAc-Galectinl-1蛋白对Thp-1细胞的抑制情况图；图2为本发明中流式细胞术检测不同Ac-Galectin-1蛋白浓度下Thp-1细胞的凋亡结果图；其中，图2-A为不同Ac-Galectin-1蛋白浓度下Thp-1细胞的凋亡流式结果图；图2-B为统计学结果图；图3为本发明中WesternBlot检测凋亡蛋白表达水平结果图；其中，图3-A为WesternBlot结果图；图3-B为统计学结果图；图4为本发明中caspase-3酶活测定结果图；图5为本发明中提取细胞膜蛋白及IP结果图；图6为本发明中Ac-Galectin-1与AnnexinA2免疫荧光共定位结果图；其中上图为Ac-Galectin-1与细胞膜蛋白AnnexinA2共定位；下图为添加乳糖后，乳糖封闭Ac-Galectin-1，未能与AnnexinA2结合；图7为本发明中Ac-Galectin-1与AnnexinA2发生相互作用IP结果图；图8为本发明中Ac-Galectin-1与AnnexinA2发生相互作用Co-IP结果图；图9为本发明中磷酸化MAPK蛋白芯片结果结果图，标黄为磷酸化水平有显著性差异的蛋白；图10-A为本发明中WesternBlot检测通路关键蛋白磷酸化水平情况及抑制剂SP6001259主要针对JNK对抑制细胞JNK磷酸化的作用；其中，图10-B、图10-C为蛋白相对灰度值柱状统计图；图11-A为本发明中WesternBlot检测通路凋亡和自噬相关蛋白表达水平情况及抑制剂SP6001259主要针对JNK对抑制细胞凋亡的作用；其中，图11-B为蛋白相对灰度值柱状统计图。具体实施方式为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范围。本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域的常规试剂；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域的常规方法。一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。进一步地，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1通过细胞膜蛋白AnnexinA2诱导Thp-1细胞凋亡的应用。进一步地，所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1在诱导细胞凋亡以及广州管圆线虫致病机制中的应用。进一步地，所述应用为Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导的细胞凋亡中作为治疗广州管圆线虫的药物靶点中的应用。进一步地，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用。进一步地，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具体操作步骤如下：①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μgmLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、18h、24h；②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；③在细胞培养箱内继续孵育2h；④在450nm处测定吸光度；⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞凋亡为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用AnnexinV-FITCPI双染色结合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；根据CCK-8结果，选择500ngmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1蛋白作用浓度，进行流式检测；同等浓度的牛血清白蛋白处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地塞米松处理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞凋亡率显著增高；具体操作步骤如下：①将0.5μgmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；②细胞消化下来后，加入细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μL结合液，轻轻重悬细胞；④加入5μL结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；⑤室温20～25℃避光孵育10min；⑥随即进行流式细胞仪检测，结合液为绿色荧光，PI为红色荧光；⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，WesternBlot检测促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理组、同等浓度的牛血清白蛋白处理组作为无关蛋白对照；与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降低；具体步骤如下：①样品制备100μgmLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴壁细胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每107个细胞加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，13000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；操作步骤如下：①测定pNA标准曲线：标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀释液；将pNA10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；②样品的收集吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g4℃离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；③样品测定如下设置反应体系：空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL取出Ac-DEVD-pNA2mM，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA2mM后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；③将细胞重新悬浮在2mLHomogenizationBuffer中，在冰上用匀浆细胞30-50次；④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并弃去沉淀；⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋白质膜；⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互作蛋白；操作步骤如下：①贴壁细胞裂解液的制备弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mL细胞裂解Buffer于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分接触；4℃，12000×g离心10min，收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；②取细胞裂解液350μL加入350μL2×IPBuffer；③将样品加入到His标签蛋白磁珠复合物中，室温孵育10min；④孵育完成后将离心管放入磁力架1min，弃去上清；⑤用300μL1×BindingWashBuffer清洗磁珠4次，加入1×BindingWashBuffer后混匀放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白复合物可用于后续分析；⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，观察电泳结果；⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE质谱鉴定；⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——免疫荧光荧光共定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与AnnexinA2可能存在相互作用：①将圆形细胞爬片加到24孔板；②将1mL含有PMA的THP-1细胞悬液滴加在爬片上，37℃培养48h，使细胞贴在爬片上，伸出伪足诱导成为贴壁细胞；③吸去上清，用37℃水浴锅预温的PBST洗涤1次，每孔加入1mL；④质量百分数为4％的多聚甲醛37℃固定细胞15min；⑤用预温的PBS静置洗涤3次，用注射器吸去；⑥质量百分数为10％的FBS37℃封闭30min，吸去FBS；⑦一抗抗体用质量百分数10％FBS稀释，放在37℃培养箱里3h，或4℃过夜；⑧用预温的PBST洗5次；⑨加用质量百分数10％FBS稀释后的HRP山羊抗兔二抗，45min，从该步起均闭光；⑩每孔加400μLDAPI染细胞核4min，预温的PBST洗5次；质量百分数为50％的甘油封片：在载玻片上加一滴质量百分数为50％甘油，然后把载玻片正面扣在甘油上，激光共聚焦显微镜镜下观察；⑻Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验按照步骤⑹的IP实验的操作步骤操作，进行IP实验即可；根据QE质谱鉴定及免疫荧光实验验证Thp-1细胞膜上的AnnexinA2可能是Ac-GaIectin-1结合作用到Thp-1细胞膜上的配体，用WesternBlot验证；⑼Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——Co-IP免疫共沉淀为了进一步证明AnnexinA2与Ac-Galectin-1相互结合，采用Co-IP免疫共沉淀方法进行验证：①抗体固定化将偶联树脂平衡至室温，用ddH2O稀释交联缓冲液至1×，轻轻摇晃偶联树脂使其重悬，使用大枪头吸取50μL均一偶联树脂至离心柱中，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min，弃流出液；用200μL1×交联缓冲液洗涤树脂，1000g离心1min并弃流出液，用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，然后插入底塞；向离心柱中加入50μg抗体，用ddH2O和20×交联缓冲液将液体体积调整至200μL；在通风厨中，吸取3μL5M氰基硼氢化钠溶液加入到200μL反应体系中；离心柱在室温条件下旋转孵育2h；离心并加入200μL1×交联缓冲液洗一次；加入200μL淬灭缓冲液，1000g离心1min，再在通风橱中加入3μL氰基硼氢化钠溶液，盖上旋盖上下颠倒轻轻混匀，室温孵育15min；卸下底塞，1000g离心1min并弃流出液，加入200μL1×交联缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复上述操作一次；加入150μL洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复六次；②哺乳动物细胞裂解胰酶消化贴壁细胞，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入1mL杜氏PBS轻悬细胞，2000rpm离心5min重复2次，获得细胞沉淀；将冰上预冷的IP裂解洗涤缓冲液加入细胞沉淀中，随后立即加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，放置冰上孵育裂解10min并充分混匀；～13000g，4℃离心10min以沉淀细胞碎片，离心后吸取上清转移到新EP管中，进行BCA法蛋白定量；③对照琼脂糖预处理细胞裂解液加入100μL1×交联缓冲液，1000g离心1min，弃流出液；轻轻重悬对照琼脂糖树脂使其均匀，对于1mg细胞裂解液中加入80μL对照琼脂糖树脂到离心柱中；4℃冰箱中旋转孵育1h，1000g离心1min，保留流出液；④免疫共沉淀加入200μLIP裂解洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液；重复该操作一次；用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，随后加入对照琼脂糖预处理过的细胞裂解液，4℃冰箱中旋转孵育过夜；去掉底塞，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min并保留流出液做后续分析；加入200μLIP裂解洗涤缓冲液并离心，该步骤重复两次；加入100μL1×条件缓冲液并离心，保留流出液，BCA检测蛋白浓度；⑤洗脱将离心柱置于一个新的离心管中，加入10μL洗脱缓冲液，1000g离心1min，加入50μL洗脱缓冲液，室温条件下静置5min，1000g离心1min，保留洗脱液并记作E1；可再次洗脱，洗脱液分别记作E2、E3；⑥将免疫共沉淀的洗脱液取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制备样品；进行WesternBlot验证，操作步骤均按照上述步骤⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达方法，采用的一抗二抗也均与步骤⑹的IP实验时一致；⑽Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——MAPK通路磷酸化蛋白芯片预实验确定通路磷酸化的时间点，用100μgmLAc-Galectin-1分别作用于Thp-1细胞0h，0.5h，1h，2h；收集细胞沉淀，RIPA裂解，加入磷酸酶抑制剂NaVO3，取RIPA裂解液40μL，加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；进行WesternBlot验证，孵育一抗Anti-phosphotyrisinerabbitpAb过夜，4℃，室温孵育抗兔二抗1h后进行曝光，成像仪成像，观察结果；筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白；①将2.0mL洗膜缓冲液TBST加入要使用的4孔多碟的每个孔中，将膜片单张放置在4孔多碟的一个孔中，摇动平台摇床上孵育1h；②当膜被封闭好后，准备样品，即未处理组Thp-1细胞裂解液和Ac-Galectin-1处理组细胞裂解液，每个样品取400μL加入样品分离管，使用缓冲液调节至1.5mL的最终体积；③向每个制备的样品中加入20μL检测抗体混合物，在室温下孵育混合1h；④从4孔多碟的孔中吸去TBST缓冲液并添加制备的样品抗体混合物，盖上4孔多碟，在摇床摇床上2-8℃孵育过夜；⑤在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑥吸取2mL1×链霉亲和素-HRP到4孔多碟的每个孔中，在室温下摇动平台摇床上孵育30min，在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑦小心地从洗涤容器中取出每个膜，每个薄膜上带有标识数字的面朝上放置，将1mL制备的Chemi试剂均匀地吸移到每个膜上；⑧成像仪曝光膜1-10min；⑾Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——WesternBlot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达①样品制备在对Thp-1细胞处理之前，先去掉含有胎牛血清的培养液，用不含胎牛血清的1640培养液使细胞饥饿12h后，特异性c-JUN抑制剂作用于细胞20min，即可达到抑制JNK磷酸化的效果，再加入100μgmlAc-Galectin-1细胞作用1h，同时10ngmlEGFR刺激Thp-1细胞，激活通路，作为阳性对照；弃去培养液，用刮铲刮下细胞，1500rpm离心l0min，收集细胞，PBS洗涤一次；每加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，2000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入l0μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；分组：空白对照组、10μMSP600125处理组、10μMSP600125+100μMAc-Galectin-1处理组、100μMAc-Galectin-1处理组、10μMEGFR处理组；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果。进一步地，所述步骤⑴CCK-8结果显示，在0-2μgmL作用浓度下细胞活性抑制率成指数增长，趋势尤为显著，因此步骤⑵中采用广州管圆线虫Galectin-1的诱导浓度为500ngmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmL。进一步地，所述步骤⑴中采用碧云天试剂公司的CCK-8检测试剂盒；或者，所述步骤⑵中采用南京建成试剂公司的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡；或者，所述步骤⑵中采用Gibco胰酶，用于消化细胞；所述步骤⑵中细胞培养液为1640细胞培养液，所述结合液为AnnexinV-FITC结合液；进一步地，所述步⑶⑾中采用CST单克隆一抗及二抗检测GAPDH、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、JNK、ERK、Akt、EGFR、AnnexinA2蛋白表达及磷酸化水平；或者，所述步骤⑷中采用碧云天碧云天试剂公司的caspase-3活性检测试剂盒；或者，所述步骤⑸采用Biovision细胞膜蛋白提取试剂盒。或者，所述步骤⑹⑻中采用SinoBiologicalIncHis-IP试剂盒。进一步地，所述步骤⑼中采用Pierce免疫共沉淀Co-IP试剂盒；或者，所述步骤⑼①中偶联树脂为加强型Amino-Link偶联树脂；或者，所述步骤⑽中筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白采用人MAPK通路磷酸化蛋白芯片试剂盒；或者，所述步骤⑽①中TBST配方为：8gNaCl、20mL1MTris-HClPH＝8.0，加入去离子水定容至1L再加入500μL吐温；或者，所述步骤⑾①中特异性c-JUN抑制剂采用Selleck特异性JNK磷酸化抑制剂SP600125。更具体地，所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具体操作步骤如下：①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μgmLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、18h、24h；②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；③在细胞培养箱内继续孵育2h；④在450nm处测定吸光度；⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞凋亡为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用AnnexinV-FITCPI双染色结合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；根据CCK-8结果，选择500ngmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1蛋白作用浓度，进行流式检测；同等浓度的牛血清白蛋白BSA处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地塞米松处理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞凋亡率显著增高；具体操作步骤如下：①将0.5μgmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；②细胞消化下来后，加入1640细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μLAnnexinV-FITC结合液，轻轻重悬细胞；④加入5μLAnnexinV-FITC结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；⑤室温20～25℃避光孵育10min。可以使用铝箔进行避光；⑥随即进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC结合液为绿色荧光，PI为红色荧光；⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，WesternBlot检测促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理组、同等浓度的牛血清白蛋白BSA处理组作为无关蛋白对照；与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白BSA处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降低；具体步骤如下：①样品制备100μgmLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴壁细胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每107个细胞加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，13000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将CST公司的一抗抗体：GAPDH内参、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax，均用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；操作步骤如下：①测定pNA标准曲线：标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀释液；将pNA10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；②样品的收集吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g4℃离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；③样品测定如下设置反应体系：空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL取出Ac-DEVD-pNA2mM，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA2mM后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；③将细胞重新悬浮在2mLHomogenizationBufferNP40中，在冰上用匀浆器Dounce匀浆细胞30-50次；④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并弃去沉淀；⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋白质膜；⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互作蛋白；操作步骤如下：①贴壁细胞裂解液的制备弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mLNP40细胞裂解Buffer于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分接触；4℃，12000×g离心10min，收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；②取细胞裂解液350μL加入350μL2×IPBuffer；③将样品加入到His标签蛋白磁珠复合物中，室温孵育10min；④孵育完成后将离心管放入磁力架1min，弃去上清；⑤用300μL1×BindingWashBuffer清洗磁珠4次，加入1×BindingWashBuffer后混匀放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白复合物可用于后续分析；⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，观察电泳结果；⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE质谱鉴定；⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——免疫荧光荧光共定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与AnnexinA2可能存在相互作用：①将圆形细胞爬片加到24孔板；②将1mL含有PMA的THP-1细胞悬液滴加在爬片上，37℃培养48h，使细胞贴在爬片上，伸出伪足诱导成为贴壁细胞；③吸去上清，用37℃水浴锅预温的PBST洗涤1次，每孔加入1mL；④质量百分数为4％的多聚甲醛37℃固定细胞15min；⑤用预温的PBST1mL静置洗涤3次，用注射器吸去；⑥质量百分数为10％的FBS37℃封闭30min400μL，吸去FBS；⑦一抗抗体用质量百分数10％FBS稀释，放在37℃培养箱里3h，或4℃过夜；⑧用预温的PBST洗5次；⑨加用质量百分数10％FBS稀释后的HRP山羊抗兔二抗，45min，从该步起均闭光；⑩每孔加400μLDAPI染细胞核4min，预温的PBST洗5次；质量百分数为50％的甘油封片：在载玻片上加一滴质量百分数为50％甘油，然后把载玻片正面扣在甘油上，激光共聚焦显微镜镜下观察；⑻Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验按照步骤⑹的IP实验的操作步骤操作，进行IP实验即可；根据QE质谱鉴定及免疫荧光实验验证Thp-1细胞膜上的AnnexinA2可能是Ac-GaIectin-1结合作用到Thp-1细胞膜上的配体，用WesternBlot验证；⑼Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——Co-IP免疫共沉淀为了进一步证明AnnexinA2与Ac-Galectin-1相互结合，采用Co-IP免疫共沉淀方法进行验证：①抗体固定化将加强型Amino-Link偶联树脂平衡至室温，用ddH2O稀释交联缓冲液至1×，轻轻摇晃加强型Amino-Link偶联树脂保存于液体中使其重悬，使用大枪头吸取50μL均一加强型Amino-Link偶联树脂至Pierce离心柱中，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min，弃流出液；用200μL1×交联缓冲液洗涤树脂，1000g离心1min并弃流出液，用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，然后插入底塞；向离心柱中加入50μg抗体，用ddH2O和20×交联缓冲液将液体体积调整至200μL；在通风厨中，吸取3μL5M氰基硼氢化钠溶液加入到200μL反应体系中；离心柱在室温条件下旋转孵育2h；离心并加入200μL1×交联缓冲液洗一次；加入200μL淬灭缓冲液，1000g离心1min，再在通风橱中加入3μL氰基硼氢化钠溶液，盖上旋盖上下颠倒轻轻混匀，室温孵育15min；卸下底塞，1000g离心1min并弃流出液，加入200μL1×交联缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复上述操作一次；加入150μL洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复六次；②哺乳动物细胞裂解胰酶消化贴壁细胞，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入1mL杜氏PBS轻悬细胞，2000rpm离心5min重复2次，获得细胞沉淀；将冰上预冷的IP裂解洗涤缓冲液加入细胞沉淀中，随后立即加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，放置冰上孵育裂解10min并充分混匀；～13000g，4℃离心10min以沉淀细胞碎片，离心后吸取上清转移到新EP管中，进行BCA法蛋白定量；③对照琼脂糖预处理细胞裂解液加入100μL1×交联缓冲液，1000g离心1min，弃流出液；轻轻重悬对照琼脂糖树脂使其均匀，对于1mg细胞裂解液中加入80μL对照琼脂糖树脂到离心柱中；4℃冰箱中旋转孵育1h，1000g离心1min，保留流出液；④免疫共沉淀加入200μLIP裂解洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液；重复该操作一次；用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，随后加入对照琼脂糖预处理过的细胞裂解液，4℃冰箱中旋转孵育过夜；去掉底塞，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min并保留流出液做后续分析；加入200μLIP裂解洗涤缓冲液并离心，该步骤重复两次；加入100μL1×条件缓冲液并离心，保留流出液，BCA检测蛋白浓度；⑤洗脱将离心柱置于一个新的离心管中，加入10μL洗脱缓冲液，1000g离心1min，加入50μL洗脱缓冲液，室温条件下静置5min，1000g离心1min，保留洗脱液并记作E1；可再次洗脱，洗脱液分别记作E2、E3；⑥将免疫共沉淀的洗脱液取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制备样品；进行WesternBlot验证，操作步骤均按照上述步骤⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达方法，采用的一抗二抗也均与步骤⑹的IP实验时一致；⑽Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——MAPK通路磷酸化蛋白芯片预实验确定通路磷酸化的时间点，用100μgmLAc-Galectin-1分别作用于Thp-1细胞0h，0.5h，1h，2h；收集细胞沉淀，RIPA裂解，加入磷酸酶抑制剂NaVO3，取RIPA裂解液40μL，加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；进行WesternBlot验证，孵育一抗Anti-phosphotyrisinerabbitpAb过夜，4℃，室温孵育抗兔二抗1h后进行曝光，成像仪成像，观察结果；筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白；①将2.0mL洗膜缓冲液TBST加入要使用的4孔多碟的每个孔中，将膜片单张放置在4孔多碟的一个孔中，摇动平台摇床上孵育1h；②当膜被封闭好后，准备样品，即未处理组Thp-1细胞裂解液和Ac-Galectin-1处理组细胞裂解液，每个样品取400μL加入样品分离管，使用缓冲液调节至1.5mL的最终体积；③向每个制备的样品中加入20μL检测抗体混合物，在室温下孵育混合1h；④从4孔多碟的孔中吸去TBST缓冲液并添加制备的样品抗体混合物，盖上4孔多碟，在摇床摇床上2-8℃孵育过夜；注意：如果不需要最佳灵敏度，则可以使用较短的孵育时间；⑤在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑥吸取2mL1×链霉亲和素-HRP到4孔多碟的每个孔中，在室温下摇动平台摇床上孵育30min，在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑦小心地从洗涤容器中取出每个膜，每个薄膜上带有标识数字的面朝上放置，将1mL制备的Chemi试剂均匀地吸移到每个膜上；⑧成像仪曝光膜1-10min；⑾Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——WesternBlot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达①样品制备在对Thp-1细胞处理之前，先去掉含有胎牛血清的培养液，用不含胎牛血清的1640培养液使细胞饥饿12h后，特异性c-JUN抑制剂作用于细胞20min，即可达到抑制JNK磷酸化的效果，再加入100μgmlAc-Galectin-1细胞作用1h，同时10ngmlEGFR刺激Thp-1细胞，激活通路，作为阳性对照；弃去培养液，用刮铲刮下细胞，1500rpm离心l0min，收集细胞，PBS洗涤一次；每加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，2000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入l0μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；分组：空白对照组、10μMSP600125处理组、10μMSP600125+100μMAc-Galectin-1处理组、100μMAc-Galectin-1处理组、10μMEGFR处理组；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果。本发明中广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有免疫抑制作用的验证方法的原理如下：通过CCK-8、流式细胞术方法检测广州管圆线虫Galectin-1蛋白对Thp-1细胞的作用，评估细胞凋亡情况。凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2检测，评估细胞凋亡情况。免疫共沉淀、免疫荧光以及质谱筛选与验证与Galectin-1蛋白相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，研究细胞凋亡的具体机制。MAPK磷酸化抗体芯片及WesternBlot进一步验证Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡的信号通路及相关蛋白。本发明方法的相关检测结果及讨论：CCK-8及流式细胞术检测结果显示，Galectin-1蛋白能够诱导Thp-1细胞发生凋亡，Galectin-1蛋白浓度增高，Thp-1细胞凋亡率也随之增高；WesternBlot结果显示，Galectin-1蛋白抑制Bcl-2蛋白表达，促进Bax、caspase-9和caspase-3蛋白表达，促进caspase-3活化；免疫共沉淀、免疫荧光及质谱检测结果表明，与Galectin-1蛋白相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白——AnnexinA2；磷酸化抗体芯片及WesternBlot验证广州管圆线虫Galectin-1引起Thp-1细胞凋亡的主要信号通路相关蛋白，促进jnk蛋白磷酸化。本发明从不同方面研究了广州管圆线虫Galectin-1蛋白具有诱导Thp-1细胞凋亡的作用，初步证实AnnexinA2蛋白是由Galectin-1引起的细胞凋亡、并与Galectin-1蛋白相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，且主要是通过EGFRMERK途径诱导细胞发生凋亡。讨论：本发明在不同方面说明广州管圆线虫Galectin-1蛋白具有诱导Thp-1细胞凋亡的作用，并且发现一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫AngiostrongylusCantonensis蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。广州管圆线虫病是一种急性感染性疾病，广州管圆线虫Galectin-1蛋白能够通过细胞膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡，在一定程度上能够损伤宿主免疫细胞，膜蛋白AnnexinA2可以作为治疗广州管圆线虫病的潜在药物作用靶点。

权利要求：1.一种Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用。2.根据权利要求1所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1通过细胞膜蛋白AnnexinA2诱导Thp-1细胞凋亡的应用。3.根据权利要求1所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1在诱导细胞凋亡以及广州管圆线虫致病机制中的应用。4.根据权利要求1所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述应用为Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导的细胞凋亡中作为治疗广州管圆线虫的药物靶点中的应用。5.根据权利要求1至4任一项所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用。6.根据权利要求5所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有通过结合Thp-1细胞膜上的膜蛋白AnnexinA2诱导细胞凋亡的作用的验证方法，步骤如下：⑴广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——CCK-8实验CCK-8实验分别检测不同作用时间：6h，12h，18h，24h，不同浓度0-100μMAc-Galectinl-1蛋白对Thp-1细胞的抑制情况，所述Ac-Galectinl-1蛋白为广州管圆线虫蛋白Galectin-1；具体操作步骤如下：①Thp-1细胞毒性实验：每孔加入100微升5000±10个细胞。按照实验需要，进行培养并给予0，0.05，0.2，0.8，3.2，12.5，25，50，100μgmLAc-Galectin-1刺激，作用6h、12h、18h、24h；②每孔加入10微升CCK-8溶液，同时设置加入相应量细胞培养液、Ac-Galectin-1和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照；③在细胞培养箱内继续孵育2h；④在450nm处测定吸光度；⑵广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——AnnexinⅤ-FITC流式方法检测细胞凋亡为了验证广州管圆线虫Galectin-1诱导THP-1细胞凋亡，采用AnnexinV-FITCPI双染色结合流式细胞术检测THP-1细胞凋亡；根据CCK-8结果，选择500ngmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1蛋白作用浓度，进行流式检测；同等浓度的牛血清白蛋白处理Thp-1细胞作为无关蛋白对照，地塞米松处理Thp-1细胞作为细胞凋亡的阳性对照；与BSA对照组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞凋亡率显著增高；具体操作步骤如下：①将0.5μgmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmLAc-Galectin-1加入到Thp-1细胞，作用18h后，37℃预温的PBS洗涤细胞一次，将Thp-1细胞用胰酶消化下来；②细胞消化下来后，加入细胞培养液转移到15mL离心管内，2000g离心5min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；③取1～5×105重悬的细胞，2000g离心5min，弃上清，加入500μL结合液，轻轻重悬细胞；④加入5μL结合液，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶PI，轻轻混匀；⑤室温20～25℃避光孵育10min；⑥随即进行流式细胞仪检测，结合液为绿色荧光，PI为红色荧光；⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1凋亡，WesternBlot检测促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白及抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量；分为正常细胞组、Ac-Galectin-1处理组、同等浓度的牛血清白蛋白处理组作为无关蛋白对照；与正常细胞组和同等浓度的牛血清白蛋白处理组相比，Ac-Galectin-1处理组细胞促凋亡蛋白caspase-3、Bax、caspase-9蛋白表达量显著增高，抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达量显著降低；具体步骤如下：①样品制备100μgmLAc-Galectin-1作用于Thp-1细胞，弃去培养液，加入PBS后用刮铲刮下贴壁细胞细胞，2000rpm离心5min，收集细胞，PBS洗涤一次；每107个细胞加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，13000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST洗涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果；⑷广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——caspase-3活性检测Caspase-3是细胞凋亡的执行分子，其发生活化引起细胞凋亡；为了进一步验证Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡，检测caspase-3的酶活性；Ac-Galectin-1引起caspase-3酶活性增高，则引起Thp-1细胞发生凋亡；操作步骤如下：①测定pNA标准曲线：标准品稀释液的配制：按照每0.9mL检测缓冲液加入0.1mL裂解液的比例配制标准品稀释液；将pNA10mM用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100、200μM，每个浓度取100μL用酶标仪进行检测，测定A405；每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线；②样品的收集吸取细胞培养液，用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞加入到新的细胞培养液中，600×g4℃离心5min收集细胞，小心吸去上清，PBS洗涤一次，再次吸尽上清后，按照每200万细胞加入100μL裂解液的比例加入细胞裂解液，重悬细胞沉淀，放置冰上裂解15min；③样品测定如下设置反应体系：空白对照:检测缓冲液40μL、待测样品0μL、裂解液50μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL样品：检测缓冲液40μL、待测样品50μL、裂解液0μL、Ac-DEVD-pNA2mM10μL取出Ac-DEVD-pNA2mM，置于冰浴上备用；在比色杯中加入Ac-DEVD-pNA2mM后混匀，在混匀时注意避免产生气泡，37℃孵育1-2h，样品的A405减去空白对照的A405，即为样品中caspase-3催化产生的pNA产生的吸光度；⑸Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——提取Thp-1细胞膜蛋白①通过4℃、700×g离心5min，收集细胞1±0.1g湿重，细胞个数为0.2-10×108，对于贴壁细胞，刮下PBS中的细胞，然后700×g离心5min，沉淀细胞；②用3mL冰冷的PBS清洗细胞一次；③将细胞重新悬浮在2mLHomogenizationBuffer中，在冰上用匀浆细胞30-50次；④将匀浆转移到1.5mL微量离心管中，在4℃条件下，700×g离心10min，收集上清液并弃去沉淀；⑤将上清液转移至新的离心管中，并在4℃以10000×g离心30min；⑥弃上清，收集白色沉淀，白色沉淀是总细胞膜蛋白质，其含有来自质膜和细胞器的蛋白质膜；⑦纯化细胞膜蛋白质，获得质膜蛋白；⑹Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验为了探究与Ac-Galectin-1相互结合的THP-1细胞膜表面受体蛋白，采用IP方法沉淀互作蛋白；操作步骤如下：①贴壁细胞裂解液的制备弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞两次，保持于冰上，再次加入PBS并用细胞刮铲刮取细胞，收集细胞并转移至15mL离心管中；向收集好的细胞中加入1mL细胞裂解Buffer于冰上孵肓10‐30min，中间晃动使裂解Buffer和细胞充分接触；4℃，12000×g离心10min，收集上清，并转移至新的离心管-20℃保存，备用；②取细胞裂解液350μL加入350μL2×IPBuffer；③将样品加入到His标签蛋白磁珠复合物中，室温孵育10min；④孵育完成后将离心管放入磁力架1min，弃去上清；⑤用300μL1×BindingWashBuffer清洗磁珠4次，加入1×BindingWashBuffer后混匀放入磁力架1min后弃去上清，收集磁珠‐His标签-蛋白-未知蛋白复合物；⑥向上述磁珠中，加入100μLHis标签洗脱液室温孵育混悬5min；⑦将离心管放入磁力架，收集上清放入新的离心管，上清中的His标签蛋白和未知蛋白复合物可用于后续分析；⑧取50μL收集的His标签蛋白和未知蛋白复合物，进行SDS‐PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，观察电泳结果；⑨将His标签蛋白和未知蛋白复合物液体以及跑胶凝胶条送去蛋白质谱检测，采用QE质谱鉴定；⑺Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——免疫荧光荧光共定位初步验证IP及QE质谱结果，即Ac-Galectin-1与AnnexinA2可能存在相互作用：①将圆形细胞爬片加到24孔板；②将1mL含有PMA的THP-1细胞悬液滴加在爬片上，37℃培养48h，使细胞贴在爬片上，伸出伪足诱导成为贴壁细胞；③吸去上清，用37℃水浴锅预温的PBST洗涤1次，每孔加入1mL；④质量百分数为4％的多聚甲醛37℃固定细胞15min；⑤用预温的PBS静置洗涤3次，用注射器吸去；⑥质量百分数为10％的FBS37℃封闭30min，吸去FBS；⑦一抗抗体用质量百分数10％FBS稀释，放在37℃培养箱里3h，或4℃过夜；⑧用预温的PBST洗5次；⑨加用质量百分数10％FBS稀释后的HRP山羊抗兔二抗，45min，从该步起均闭光；⑩每孔加400μLDAPI染细胞核4min，预温的PBST洗5次；质量百分数为50％的甘油封片：在载玻片上加一滴质量百分数为50％甘油，然后把载玻片正面扣在甘油上，激光共聚焦显微镜镜下观察；⑻Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——IP实验按照步骤⑹的IP实验的操作步骤操作，进行IP实验即可；根据QE质谱鉴定及免疫荧光实验验证Thp-1细胞膜上的AnnexinA2可能是Ac-GaIectin-1结合作用到Thp-1细胞膜上的配体，用WesternBlot验证；⑼Ac-Galectin-1与Thp-1细胞膜上AnnexinA2相互作用——Co-IP免疫共沉淀为了进一步证明AnnexinA2与Ac-Galectin-1相互结合，采用Co-IP免疫共沉淀方法进行验证：①抗体固定化将偶联树脂平衡至室温，用ddH2O稀释交联缓冲液至1×，轻轻摇晃偶联树脂使其重悬，使用大枪头吸取50μL均一偶联树脂至离心柱中，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min，弃流出液；用200μL1×交联缓冲液洗涤树脂，1000g离心1min并弃流出液，用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，然后插入底塞；向离心柱中加入50μg抗体，用ddH2O和20×交联缓冲液将液体体积调整至200μL；在通风厨中，吸取3μL5M氰基硼氢化钠溶液加入到200μL反应体系中；离心柱在室温条件下旋转孵育2h；离心并加入200μL1×交联缓冲液洗一次；加入200μL淬灭缓冲液，1000g离心1min，再在通风橱中加入3μL氰基硼氢化钠溶液，盖上旋盖上下颠倒轻轻混匀，室温孵育15min；卸下底塞，1000g离心1min并弃流出液，加入200μL1×交联缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复上述操作一次；加入150μL洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液，重复六次；②哺乳动物细胞裂解胰酶消化贴壁细胞，2000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入1mL杜氏PBS轻悬细胞，2000rpm离心5min重复2次，获得细胞沉淀；将冰上预冷的IP裂解洗涤缓冲液加入细胞沉淀中，随后立即加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，放置冰上孵育裂解10min并充分混匀；～13000g，4℃离心10min以沉淀细胞碎片，离心后吸取上清转移到新EP管中，进行BCA法蛋白定量；③对照琼脂糖预处理细胞裂解液加入100μL1×交联缓冲液，1000g离心1min，弃流出液；轻轻重悬对照琼脂糖树脂使其均匀，对于1mg细胞裂解液中加入80μL对照琼脂糖树脂到离心柱中；4℃冰箱中旋转孵育1h，1000g离心1min，保留流出液；④免疫共沉淀加入200μLIP裂解洗涤缓冲液，1000g离心1min并弃流出液；重复该操作一次；用纸巾吸去离心柱底部多余的液体，随后加入对照琼脂糖预处理过的细胞裂解液，4℃冰箱中旋转孵育过夜；去掉底塞，将离心柱置于收集管中，1000g离心1min并保留流出液做后续分析；加入200μLIP裂解洗涤缓冲液并离心，该步骤重复两次；加入100μL1×条件缓冲液并离心，保留流出液，BCA检测蛋白浓度；⑤洗脱将离心柱置于一个新的离心管中，加入10μL洗脱缓冲液，1000g离心1min，加入50μL洗脱缓冲液，室温条件下静置5min，1000g离心1min，保留洗脱液并记作E1；可再次洗脱，洗脱液分别记作E2、E3；⑥将免疫共沉淀的洗脱液取40μL，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制备样品；进行WesternBlot验证，操作步骤均按照上述步骤⑶广州管圆线虫Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡——WesternBlot检测凋亡蛋白的表达方法，采用的一抗二抗也均与步骤⑹的IP实验时一致；⑽Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——MAPK通路磷酸化蛋白芯片预实验确定通路磷酸化的时间点，用100μgmLAc-Galectin-1分别作用于Thp-1细胞0h，0.5h，1h，2h；收集细胞沉淀，RIPA裂解，加入磷酸酶抑制剂NaVO3，取RIPA裂解液40μL，加入10μL5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；进行WesternBlot验证，孵育一抗Anti-phosphotyrisinerabbitpAb过夜，4℃，室温孵育抗兔二抗1h后进行曝光，成像仪成像，观察结果；筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白；①将2.0mL洗膜缓冲液TBST加入要使用的4孔多碟的每个孔中，将膜片单张放置在4孔多碟的一个孔中，摇动平台摇床上孵育1h；②当膜被封闭好后，准备样品，即未处理组Thp-1细胞裂解液和Ac-Galectin-1处理组细胞裂解液，每个样品取400μL加入样品分离管，使用缓冲液调节至1.5mL的最终体积；③向每个制备的样品中加入20μL检测抗体混合物，在室温下孵育混合1h；④从4孔多碟的孔中吸去TBST缓冲液并添加制备的样品抗体混合物，盖上4孔多碟，在摇床摇床上2-8℃孵育过夜；⑤在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑥吸取2mL1×链霉亲和素-HRP到4孔多碟的每个孔中，在室温下摇动平台摇床上孵育30min，在摇床上用1×清洗缓冲液清洗每个膜10min，共洗三次；⑦小心地从洗涤容器中取出每个膜，每个薄膜上带有标识数字的面朝上放置，将1mL制备的Chemi试剂均匀地吸移到每个膜上；⑧成像仪曝光膜1-10min；⑾Ac-Galectin-1诱导Thp-1细胞凋亡磷酸化信号通路的探究——WesternBlot检测凋亡信号通路相关蛋白的表达①样品制备在对Thp-1细胞处理之前，先去掉含有胎牛血清的培养液，用不含胎牛血清的1640培养液使细胞饥饿12h后，特异性c-JUN抑制剂作用于细胞20min，即可达到抑制JNK磷酸化的效果，再加入100μgmlAc-Galectin-1细胞作用1h，同时10ngmlEGFR刺激Thp-1细胞，激活通路，作为阳性对照；弃去培养液，用刮铲刮下细胞，1500rpm离心l0min，收集细胞，PBS洗涤一次；每加50μL细胞裂解液，冰上裂解l0min后，2000rpmmin离心l0min，收集上清，取40μL，加入l0μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸l0min制各样品；分组：空白对照组、10μMSP600125处理组、10μMSP600125+100μMAc-Galectin-1处理组、100μMAc-Galectin-1处理组、10μMEGFR处理组；②SDS—PAGE电泳；③转膜：依次按照滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸自上而下的顺序放置于半干转仪中，用玻璃棒将气泡赶尽，电压15V，转膜30min；④封闭：转膜结束后将PVDF膜用质量浓度为5％的脱脂牛奶室温封闭2h，然后用TBST洗涤3次，每次10mim；⑤孵育一抗：将一抗抗体用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:1000稀释，室温孵育2h；然后用TBST洗涤3次，每次10min；⑥孵育二抗：HRP标记的山羊抗小鼠或抗兔IgG二抗用质量浓度为5％的脱脂牛奶按体积比1:5000稀释，室温孵育1h；然后用TBST涤5次，每次10min；⑦曝光：洗涤完毕后，孵育发光液2min后进行曝光，成像仪成像，观察结果。7.根据权利要求6所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述步骤⑴CCK-8结果显示，在0-2μgmL作用浓度下细胞活性抑制率成指数增长，趋势尤为显著，因此步骤⑵中采用广州管圆线虫Galectin-1的诱导浓度为500ngmL、1μgmL、1.5μgmL、2μgmL。8.根据权利要求6所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述步骤⑴中采用碧云天试剂公司的CCK-8检测试剂盒；或者，所述步骤⑵中采用南京建成试剂公司的AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡；或者，所述步骤⑵中采用Gibco胰酶，用于消化细胞；所述步骤⑵中细胞培养液为1640细胞培养液，所述结合液为AnnexinV-FITC结合液。9.根据权利要求6所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述步⑶⑾中采用CST单克隆一抗及二抗检测GAPDH、caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、JNK、ERK、Akt、EGFR、AnnexinA2蛋白表达及磷酸化水平；或者，所述步骤⑷中采用碧云天试剂公司的caspase-3活性检测试剂盒；或者，所述步骤⑸采用Biovision公司的MembraneProteinExtractionKit细胞膜蛋白提取试剂盒；或者，所述步骤⑹⑻中采用SinoBiologicalIncHis-IP试剂盒。10.根据权利要求6所述的Thp-1细胞上的膜蛋白AnnexinA2在广州管圆线虫蛋白Galectin-1诱导凋亡中的应用，其特征在于：所述步骤⑼中采用免疫共沉淀Co-IP试剂盒；或者，所述步骤⑼①中偶联树脂为加强型Amino-Link偶联树脂；或者，所述步骤⑽中筛选细胞凋亡磷酸化信号通路相关蛋白采用人MAPK通路磷酸化蛋白芯片试剂盒；或者，所述步骤⑽①中TBST配方为：8gNaCl、20mL1MTris-HClPH＝8.0，加入去离子水定容至1L再加入500μL吐温；或者，所述步骤⑾①中特异性c-JUN抑制剂采用Selleck特异性JNK磷酸化抑制剂SP600125。

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