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申请/专利权人：云南省烟草农业科学研究院

摘要：本发明公开了一种烟草尼古丁含量调控基因NtCLC‑b，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID：No.2所示；所述烟草尼古丁含量调控基因NtCLC‑b包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示本发明还公开了所述调控基因NtCLC‑b的克隆方法及其应用。在烟草植株内过量表达NtCLC‑b基因，可以明显降低烟叶中尼古丁的含量，在实际生产中拥有广阔的应用前景。

主权项：1.一种烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b的应用，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQID：No.2所示；其特征在于在烟草植株体内过量表达所述NtCLC-b基因能够降低烟草中尼古丁的含量。

全文数据：一种烟草尼古丁含量调控基因NtCLC-b及其克隆方法与应用技术领域[0001]本发明属于遗传工程技术领域，进一步属于涉及烟草尼古丁的合成及调控相关基因，具体涉及一种烟草尼古丁含量的调控基因MCLC-b及其克隆方法与应用。背景技术[0002]研究烟草尼古丁的代谢调控是非常有意义的一项工作，通过基因调控可以提供不同尼古丁含量的烟草品种，为烟草商业生产个性化尼古丁烟草产品提供原材料。尼古丁对人体有很强的生理刺激作用，是烟草商业性使用的物质基础。许多世界顶级烟草公司如菲利普莫里斯，帝国烟草、日本烟草、英美烟草等公司都投入巨资对烟草尼古丁的代谢途径、调控机制进行研究。[0003]尼古丁是一种卩比啶类生物碱，主要存在于前科烟草属Vicoiiana植物中，是烟草体内的一种重要的次生代谢产物。烟草尼古丁的合成和转运受到多个因素的调控，目前已经鉴别和克隆出来了一些尼古丁合成途径中的关键基因，如0PT、PMT、MPO、等。[0004]从分子生物学角度对尼古丁的合成代谢途径研究尚未完全透彻。通过氯离子通道调控尼古丁合成基因，从而影响尼古丁含量的研究未见报道。尼古丁调控基因对于烟草商业生产至关重要，目前大多数的尼古丁合成基因相关专利都掌握在国外烟草公司手中。因此，研究尼古丁合成途径相关调控基因对中国烟草企业改良烟草产品中尼古丁含量具有重要意义。发明内容[0005]本发明的第一目的在于提供一种烟草尼古丁含量调控基因财CLC-b，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID:No.2所示。[0006]本发明的第二目的在于提供所述烟草尼古丁含量调控基因MCLC-b包含的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQID:No.l所示。[0007]本发明的第三目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因财CLC-b的克隆方法，包括以下步骤：1烟草叶片cDNA合成:提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA;OWtCLC-b基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据咐CLC-b基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。[0008]本发明的第四目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因财CLC-b的应用，即在烟草植株体内过量表达所述基因，可降低烟草中尼古丁的含量。[0009]本发明的第五目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因财CLC-b的重组载体。[0010]本发明的第六目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因咐ac-b的表达盒。[0011]本发明的第七目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因的转基因细胞系。[0012]本发明的第八目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因咐CLC-b的重组菌。附图说明[0013]图IjViCLC-b的PCR产物电泳图；图中，M-分子量标记；I-PCR产物；图2中间载体Pdonr-zeo图；图3MCLC-b基因植物表达载体ro2GW7图；图4转MCLC-b基因过表达载体的烟草株系基因表达水平柱状图；图中，OE-I为过表达1株系，0E-2为过表达2株系，K326为野生型烟株对照；图5MCLC-b基因过表达烟草植株的尼古丁含量。[0014]图中，OE-I为过表达1株系，0E-2为过表达2株系，K326为野生型烟株对照。具体实施方式[0015]下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。[0016]本发明所述的烟草尼古丁含量调控基因财CLC-b编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQID:No.2所示。所述多肽还可能为由SEQIDN〇:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加而形成，且具有调控烟草尼古丁含量的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加。[0017]本发明所述烟草尼古丁含量调控基因财CLC-b包含的核苷酸序列如SEQID:No.l所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQIDN〇:l限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQIDNo:1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。[0018]本发明所述烟草尼古丁含量调控基的克隆方法包括以下步骤：1烟草叶片cDNA合成:提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA;OWtCLC-b基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据咐CLC-b基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物并测序。[0019]作为本发明的一种优选，所述引物为：正向引物：5’_ATGGAGGAGCCAACTCGATTAGTAG-3’；反向引物：5’-TCAGTTCCCCTTTTTACCGCTTTTTG-3’。[0020]本发明所述烟草尼古丁含量调控基的应用为在烟草植株体内过量表达基因，可降低烟草中尼古丁的含量。可通过多种方法实现过量表达基因，如:植物病毒载体介导基因过表达的方法、农杆菌介导转化过表达载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法。本发明所述的过量表达基因的方法并不限于上述几种方法，只要能过量表达ViCLC-b即可。[0021]本发明的财CLC-b基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记GiS基因、荧光素酶基因等或具有抗性的抗生素标记物庆大霉素，卡那霉素等）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如:烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。携带有本发明MCLC-b基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。[0022]含有本发明所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、和重组菌等基因工程产品均属于本发明的保护范围。[0023]本发明的烟草尼古丁调控相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草尼古丁含量育种提供基因与技术的支持。[0024]本发明中，在烟草植株内过表达烟草内源ViCLC-b，会使烟草烟叶的尼古丁含量明显降低，在植物尼古丁育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。[0025]下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。[0026]实施例中所有的植物组织材料取自烤烟〇Vicotiam_atabacuΏ品种‘K326’及过表VtCLC-b基因‘K326’植株。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25Γ之间，以尽量减少外界环境因素对烟草尼古丁合成过程中的影响。实验选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株。采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。将这些烟草材料杀青以进行尼古丁含量检验。[0027]实施例1:克隆WiCLC-b基因以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行咐CLC-b基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。设计引物如下所示：正向引物：5’_ATGGAGGAGCCAACTCGATTAGTAG-3’；反向引物：5’-TCAGTTCCCCTTTTTACCGCTTTTTG-3’。[0028]PCR反应体系和扩增条件如表1所示。[0029]表IPCR反应体系与条件将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示。电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。[0030]实施例2:植物转化载体构建以实施例1中WtCLC-b全长片段为模板，用含有Gateway接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体中。将构建好的BP反应载体通过LR反应将MCLC-b片段置换到PB2GW7过表达载体中。具体步骤如下：1根据烟草基因组中筛选出的财CLC-b基因序列设计引物，并根据Gateway系统中的BP反应要求，在正向引物前加上5’-GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC-3’序列，在反向引物前加5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3’序列。得到Gateway反应引物序列如下：NtCLC-b_F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGAGGAGCCAACTCGATTAGTAG-3’；NtCLC-b_R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGTTCCCCTTTTTACCGCTTTTTG-3’。[0031]2PCR反应均采用Phusion高保真聚合酶进行PCR克隆。[0032]PCR反应体系与条件与实施例1相同。[0033]3BP反应：a在200yL离心管中准备8yL的反应体系，包括：1-7yL的attB-PCR产物（约15〜150ng，质量浓度150ngyL的pdonr-zeo载体和适量的TE缓冲液pH8.0，在室温下混匀；b将BPClonaseTMII酶混合物在冰上静置2min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；c向（1准备的样品中加入2yL的BPClonaseTMII酶混合物，轻轻地将体系混匀；d将BPClonase™II酶混合物放回到-20°C或者-80°C保存；e将反应体系放在25°C温浴Ih;f向反应体系中加入IyL的蛋白酶K溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37°C温浴10min，以便终止BP反应；g将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含Zeacin抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆的PDONR-Zeocin质粒（图2备用。[0034]4LR反应：a在200yL离心管中准备8yL的反应物，包括：1-7yL的获得的pDONR-Zeocin质粒50-150ng、lyL150ngyL的PB2GW7载体和适量的TE缓冲液pH8.0，在室温下混匀；b将LRClonaseTMII酶混合物静置在冰上2min融化，轻轻震荡2次以混匀；c加入2yL的LRClonaseTMII酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；d将LRClonaseTMII酶混合物放回到-20°C或者-80°C冰箱保存；e将反应体系放在25°C温浴反应Ih;f向反应体系中加入IyL的蛋白酶K溶液以终止LR反应，轻轻震荡后，将样品放在37°C静置10min;得到PB2GW7重组载体。[0035]实施例3:农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定1冻融法转化农杆菌将Iyg200ngyLPB2GW7重组载体加入到100yL感受态农杆菌LBA4404中，混匀后在冰上静置5min，放入液氮中冷冻5min，然后从液氮中取出，放入37°C水浴锅中水浴5min，再在冰上静置5min后，加入500yLLB溶液，在28°C、充分震荡条件下恢复培养4h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28°C下培养48h。[0036]2叶盘法转化烟草品种K326。[0037]具体方法如下：a无菌条件下，将烟草K326种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；b于75%的酒精中浸泡30-60s;c再用0.1%的升萊处理5min，最后用无菌水冲洗5次；d播种于MS培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4d,25°C光照培养20-30d。[0038]e待烟草苗长至3-5cm时（20-30d，取顶芽放于MS+BA0.2mgL壮芽，使其快速成长培养基上，继代培养。[0039]f继代培养14天后有小叶片即可），取叶片，大小IcmXIcm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+BA1.0mgLpH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3d。[0040]g然后取出预培养的叶片或茎段，放入农杆菌侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2mL离心管装满菌液，4000rmin离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10mL悬菌液放1管1.5mL菌体放入悬菌液，加入As25mgL40mL中加40μLAs不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液。[0041]其中，农杆菌侵染液的制备方法如下：1取-80°C冰箱保存的已被转化的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加入50mgLspec和50mgLRif;2挑取单菌斑到含50mgLspec和50mgLRif的5mLLB液体培养基中，放入摇床中28°C、200rmin培养过夜（12-16h;3保存菌种，750yL菌液加入灭过菌的甘油250yL，-80°C冰箱保存备用。[0042]4摇菌，LB液体培养基10mL加spec所需浓度50mgL10yL、Rif所需浓度50mgL10yL及菌液10yL，28°C、200rmin过夜培养（12-16h。[0043]5当菌液浓度达到OD6〇q=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rmin离心5min；6倒掉上清液，吸ImL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000rmin离心5min。[0044]7重复步骤61次；8用ImL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中（含40yL25mgL的As，即为侵染液。放置2h以上，再侵染。[0045]200mL悬菌液的配制如下：20X大量元素10mL200X有机元素Iml200X铁盐ImL200X微量元素ImL鹿糖5.6gh将叶片及茎段放回到预培养基上，28°C黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；⑴洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mgLCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；j取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+BA1.0mgL+Hyg25mgL+Cef500mgLpH5.8;过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。[0046]k每2周更换1次培养基，直至长出不定芽一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm左右），转入继代培养基MS+BA0.2-0.1mgL+Hyg25mgL+Cef500mgLpH5.8;I至小苗长至2cm长时有小芽即可），转接入生根培养基MS+NAA0.2-0.lmgL上，24士l°C、12h光照、1500Ix培养3周左右，长出粗壮根系。[0047]m待根生长至2-3cm。苗高7-lOcm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。[0048]3得到稳定的转基因株系采用Qiagen公司DNA提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，设计Basta抗性基因引物进行PCR扩增，筛选阳性植株，检测到25株阳性植株。[0049]检测引物为：BASTA_F:5’_ACAAGCACGGTCAACTTCC-3’；BASTA_R:5’-ACTCGGCCGTCCAGTCGTA-3’。[0050]提取野生型植株和25株转咐CLC-b的TO代植株的总RNA，进行实时荧光定量PCRqRT-PCR分析，内参基因为26S，分析不同株系的表达情况。选取表达量最高的2株植株OE-I和0E-2图4。单株收取种子分别播种，用basta抗生素筛选Tl代植株的分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系。[0051]NtCLC-bqRT引物：NtCLC-b_qRT_F:5’-GCTCACTTTGATAGCTGCCC-3’；NtCLC-b_qRT_R:5’-AAGCGCCAATGTGAACCAAT-3’〇[0052]26s内参基因引物：26s_F：5,-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3,；26s_R:5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’。[0053]实施例4:测定烟叶中尼古丁含量依据标准YCT160-2002检测中烟草材料的尼古丁含量。选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株为处理对象，以野生型烟草K326为对照。取5株非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对5株非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。[0054]用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的总植物碱（以尼古丁计与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，氯化氰由氰化钾和氯胺T在线反应产生。反应产物用比色计在460nm测定。[0055]主要仪器设备:连续流动分析仪美国API德国SEALAA3法国ALLIANCE。[0056]配置试剂：Brij35溶液聚乙氧基月桂醚）：水中加5滴22%Brij35,搅拌均匀。[0057]缓冲溶液A:称取2.35g氯化钠NaCl，7.60g硼酸钠Na2B4O3·IOH2O，用水溶解，然后转入IL容量瓶中，加入ImLBrij35,用蒸馏水稀释至1L。使用前用定性滤纸过滤。[0058]缓冲溶液B:称26g磷酸氢二钠（Na2HPO4，10·4g柠檬酸[COHCOOHCH2⑶0H2·H2O]，7g对氨基苯磺酸NH2C6H4SO3H,用水溶解，然后转入IL容量瓶中，加入ImLBrij35，用蒸馏水稀释至1L。使用前用定性滤纸过滤。[0059]氯胺T溶液N-氯-4-甲基苯硫酰胺钠盐）[CH3C6H4SO2NNaCl·3H20]:取8.65g氯胺T，溶于水中，然后转入500mL的容量瓶中，用水定容至刻度。使用前用定性滤纸过滤。[0060]0.22molLNaOH缓冲液：NaOH8.8g，Na2HP〇426.^，06118〇7.112〇—水柠檬酸）10.4g，用水溶解并定容至1000mL。[0061]对氨基苯磺酸缓冲液：称取C6H7NO3S对氨基苯磺酸）7g，Na2HP〇426.Og，C6H8O7.H2O—水柠檬酸）10.4g，用水溶解并定容至1000mL。[0062]氯胺T:称取氯胺T1.2g，用纯水溶解定容至100mL，用棕色试剂瓶保存。[0063]氰化钾:KCN0.4g，用纯水溶解定容至IOOmL。[0064]NaCO3溶液：10gNaCO3,蒸馏水溶解并定容至1000mL。[0065]分析步骤:称取0.3g烟样于150mL三角瓶或塑料瓶中（精确至O.OOOlg;加入50mL5%乙酸溶液盖上塞子;在普通摇床上振荡萃取30min，转速控制170rmin，用滤纸过滤上机。（如样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释）。[0066]结果的计算与表述：以干基计的总植物碱的含量，由下面公式得出：式中：C一一样品液总植物碱的仪器观测值，单位为mgmL;V萃取液的体积，单位为mL;m--试料的质量，单位为mg;W—试样的水分含量，单位为％。[0067]以两次测定的平均值作为测定结果，结果精确至0.01%。[0068]试验结果表明：0E-1的尼古丁含量约为对照的一半，而0E-2的尼古丁含量约为对照的25%图5。打顶与未打顶烟株的上中下部烟叶尼古丁含量都表现出明显的降低，说明过表达Wtac-b基因能够有效降低烟叶中的尼古丁含量。

权利要求：1.一种烟草尼古丁含量调控基因财CLC-b，其特征在于，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包括的氨基酸序列如SEQID:No.2所示。2.根据权利要求1所述烟草尼古丁含量调控基因咐CLC-b，其特征在于，所述烟草尼古丁含量调控基因MCLC-b包含的核苷酸序列如SEQID:No.1所示。3.—种权利要求1或2任一所述烟草尼古丁含量调控基因咐CLC-b的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：1烟草叶片cDNA合成:提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA;2^αΧ-6基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据WtCLC-b基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。4.根据权利要求3所述烟草尼古丁含量调控基因咐CLC-b的克隆方法，其特征在于，所述引物为正向引物：5’_ATGGAGGAGCCAACTCGATTAGTAG-3’；反向引物:5’-TCAGTTCCCCTTTTTACCGCTTTTTG-3’。5.—种权利要求1或2任一所述烟草尼古丁含量调控基因WtCLC-b的应用，其特征在于，在烟草植株体内过量表达所述基因，可降低烟草中尼古丁的含量。6.—种根据权利要求5所述烟草尼古丁含量调控基因咐CLC-b的应用，其特征在于，所述过量表达wtac-b基因的方法包括植物病毒载体介导基因过表达，或农杆菌介导转化过表达载体，或优化修改基因编码匡，或优化基因启动子。7.—种含有权利要求1或2任一所述烟草尼古丁含量调控基因MCLC-b的重组载体。8.—种含有权利要求1或2任一所述烟草尼古丁含量调控基因MCLC-b的表达盒。9.一种含有权利要求1或2任一所述烟草尼古丁含量调控基因WtCLC-b的转基因细胞系。10.—种含有权利要求1或2任一所述烟草尼古丁含量调控基因MCLC-b的重组菌。

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