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申请/专利权人：上海大学

摘要：本发明涉及一个玉米籽粒转录因子在调控醇溶蛋白方面的应用。该基因为SEQIDNO：1所示的碱基序列。该序列编码的蛋白ZmbZIP22可直接结合并激活27kDaγ‑醇溶蛋白启动子。利用CRISPR‑Cas9技术将ZmbZIP22的基因片段SEQIDNO：2作为guideRNA进行转化玉米幼胚，并获得基因缺失突变体的植株。相对野生型籽粒而言，转基因突变体玉米籽粒出现不规则且较薄的蛋白体外壳，成熟籽粒的醇溶蛋白含量显著下降，常规玉米缺乏的赖氨酸等必需氨基酸含量显著上升，从而提高了玉米的营养品质。

主权项：1.一种玉米转录因子ZmbZIP22，其特征在于,该转录因子能够利用酵母单杂实验筛选玉米籽粒储藏蛋白27kDaγ-醇溶蛋白，其基因序列为SEQIDNO:1所示的碱基序列。

全文数据：玉米转录因子ZmbZIP22及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种玉米转录因子ZmbZIP22及其应用。技术背景[0002]玉米Zeanays是世界上产量最高的禾本科作物之一。除了作为粮食外，玉米还是禽畜重要的饲料来源，也是重要的工业原料。因此玉米对于社会的进步起到了重要的作用。随着人们生活水平的不断提高，对于所摄取食物的品质也提出了更高的要求。因此玉米品质的提升成为一个重要的研宄课题。玉米籽粒的主要成分包括淀粉、蛋白质和油脂，其中蛋白质决定了玉米籽粒的营养价值，因而玉米的蛋白质品质是一个重要的研究性状。[0003]醇溶蛋白是玉米籽粒中的主要储藏蛋白，占总蛋白的㈤％以上，然而其赖氨酸、色氨酸和甲硫氨酸等必需氨基酸含量极低，导致传统的玉米籽粒中氨基酸组成不均衡。其中赖氨酸的欠缺尤为严重，玉米在作为禽畜饲料时仍需添加人工合成的赖氨酸或其他富含赖氨酸的蛋白质。在籽粒主要农艺性状不改变的条件下，降低籽粒中醇溶蛋白的比例能够显著地提高籽粒赖氨酸的相对含量，从而提高籽粒的蛋白质品质。[0004]玉米籽粒中醇溶蛋白由4个基因家族编码，分为a-zeinMr19kDa、22kDa，p-zeinMr14kDa，y-zeinMr16kDa、27kDa，5-zeinMr10kDa、15kDa。醇溶蛋白通过形成蛋白体来在玉米籽粒胚乳中储藏。在各类醇溶蛋白中27kDay-醇溶蛋白的表达在籽粒发育过程中最早出现，这主要是由于27kDa丫_醇溶蛋白分布在蛋白体的外壳区域，其主要功能是促使蛋白体的初始形成。己有的DNaseIfootprint研究表明，在27kDay-醇溶蛋白基因启动子上，仍有未知的转录因子参与其表达调控。[0005]鉴于27kDaY-醇溶蛋白在胚乳中表达量极高，对于蛋白体形成，乃至储藏蛋白累积过程的重要作用，寻找其他参与27kDaY_醇溶蛋白转录调控的转录因子将有利于降低醇溶蛋白的累积，提高非醇溶蛋白的比例，从而提高玉米的营养品质。[0006]酵母单杂交技术Y1H是采用已知启动子筛选其相互作用的蛋白的经典技术。利用该技术可以实现对目标启动子互作蛋白的大规模筛选。但是其弊端是背景较高。[0007]染色质免疫共沉淀实验Chip是一种验证启动子与蛋白相互作用的技术。利用这项技术，可以对酵母单杂交方法筛选到的蛋白进行验证。[0005]双荧光转录激活检测系统是一种验证转录因子与启动子是否结合并激活下游基因表达的技术，该技术可以验证酵母单杂交技术得到的目标蛋白是否能够直接调控该启动子所驱动的基因。发明内容[0009]本发明的目的之一在于提供—种转录因子Zmbzip22。[0010]本发明的目的之二在于提供该转录因子ZmbZIP22的应用。[0011]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种玉米转录因子ZmbZIP22,其特征在于该转录因子具有SE}IDN〇:1所示的碱基序列。[0012]—种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的转录因子ZmbZIP22。[0013]上述载体是zmbZIP22的CRISPR-Cas9转基因载体。[0014]—种上述的转录因子ZmbZIP22在调控玉米籽粒储藏蛋白27kDay-醇溶蛋白中的应用。[0015]—种上述的转录因子ZmbZIP22在结合并转录激活27kDa丫_醇溶蛋白的启动子中的应用。[0016]一种转录因子ZmbZIP22转基因CRISPR-Cas9表达载体的构建方法，其特征在于采用0〇4燃1^433仍为转基因载体，将3£51〇觸:2所示序列作为81?熟8。3〇6；1：和8。3€;^11连入转基因载体中获得，其中载体经过改造，以玉米TO启动子和终止子表达gRNA，同时以玉米泛素启动子和N0S终止子表达玉米密码子优化的Cas9蛋白。[0017]一种玉米转录因子ZmbZIP22基因突变后在农业高品质玉米育种方面的应用，其特征在于籽粒赖氨酸和甲硫氨酸含量的上升、醇溶蛋白含量的下降导致蛋白质品质的提升。[0018]本发明通过ChIP-qPCR和双荧光转录激活实验明确了ZmbZIP22在体内能直接结合并激活27kDay-醇溶蛋白基因启动子。[0019]通过对醇溶蛋白基因的定量PCR实验证明了该基因在转基因缺失突变后会导致27kDa醇溶蛋白的表达下降。[0020]通过醇溶蛋白抽提实验以及蛋白定量证明了醇溶蛋白的累积在突变体中下降。[0021]通过透射电镜观察证明了该基因在转基因突变后会导致细胞内蛋白体外壳变薄且不规则。[0022]通说总氨基酸定量明确了该基因在转基因突变后赖氨酸和甲硫氨酸等必需氨基酸含量显著提高。[0023]本发明通过酵母单杂交技术找到了27kDa丫_醇溶蛋白基因的转录因子ZmbZIP22,并通过ChIP-qPCR和转录激活测试进行了验证。CRISPR_Cas9基因编辑的方法获得了该转录因子的突变体转基因玉米，通过醇溶蛋白抽提，透射电镜观察等对转基因材料进行了表型分析，发现醇溶蛋白在突变体中显著下降，籽粒的蛋白质品质得到了提升。[0024]本发明发现了一个新的27kDa醇溶蛋白基因的转录调控因子，能够直接影响醇溶蛋白表达，在细胞学上对蛋白体的结构和形状产生影响。通过CRISPR-Cas9基因突变创造的突变体玉米在醇溶蛋白累积中有明显下降，赖氨酸和甲硫氨酸含量显著提升，从而使籽粒的营养品质显著提升。附图说明[0025]图1是酵母单杂筛库获得的阳性克隆滴板验证结果图。实验采用27kDaY-醇溶蛋白启动子序列为饵，筛选了玉米籽粒发育各时期的cDNA文库。[0026]图2是通过ChIP-qPCR实验验证ZmbZIP22在体内与27kDay-醇溶蛋白启动子的直接结合。[0027]图3是双荧光转录激活系统载体的构建示意图。[0028]图4是通过双荧光转录激活系统验证ZmbZIPM对27kDay-醇溶蛋白启动子的转录激活。[0029]图5是ZmbZIP22转基因CRISPR-Cas9载体构建示意图。[0030]图6是ZmbZIP22CRISPR-Cas9基因编辑两个阳性事件籽粒中在基因组水平的编辑情况。[0031]图7是ZmbZIP22CRISPR_Cas99号事件未成熟籽粒中ZmbZIP22在蛋白水平的表达量检测。[0032]图8是ZmbZIPMCRISPR_Cas99号与10号事件中27kDay-醇溶蛋白转录水平的表达量检测。[0033]图9是ZmbZIPMCRISPR_Cas99号与10号事件中总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的定量分析。[0034]图10是ZmbZIP22CRISPR_Cas99号与10号事件中醇溶蛋白的SDS-PAGE检测。[0035]图11是ZmbZIP22CRISPR_Cas99号事件未成熟种子的透射电镜观察。[0036]图12是ZmbZIP22CRISPR_Cas99号事件成熟籽粒的总赖氨酸和甲硫氨酸定量。具体实施方式[0037]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.或植物分子生物学一实验手册（PlantMolecularBiology—ALaboratoryManual,MelodyS.Clark编，Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0038]实施例一:利用酵母单杂实验筛选27kDa丫_醇溶蛋白的潜在转录因子首先采取了SMART方法，获得了均一化的玉米籽粒cDNA片段。将该cDNA片段与单杂载体pG仙77-7feC2连接转化，获得了约1.OX1〇6个克隆。在饵质粒的构建中，采用27kDay-醇溶蛋白基因启动子为饵。[0039]结果:通过PEGLiAc法将构建的库质粒以及饵质粒转入酵母Y187中，得到10s个酵母转化子。通过DD0与TD0的筛选，共获得了27个疑似阳性克隆。对这些克隆质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个bZIP类型的转录因子基因ZfflbZJPM，参见图1。[0040]实施例二:ZmbZIP22与27kDay-醇溶蛋白基因启动子体内结合的验证1.取授粉后15天的野生型未成熟玉米籽粒，采用1%的甲醛进行真空交联。[°041]2•对交联过的籽粒进行细胞核抽提，并超声将染色质打断为300bp左右的片段。[0042]3.加入兔免疫前血清，4°C孵育lh，对染色质进行预纯化。[0043]4•加入40ylGEProteinAagarosebeads，4°C孵育lh。[0044]5•将孵育后液体800g离心2min，将上清分成两等分，分别加入自制的ZmbZIP22抗体和等量的IgG，4°C孵育过夜。[0045]6•加入20ulGEProteinAagarose匕6818,4。〇孵育9〇111；[11。[0046]7•离心，用IPbuffer洗柱子，共5遍。[0047]8•用洗脱缓冲液进行洗脱。加入ProteinaseK对免疫沉淀到的染色质蛋白进行消化，55°C去交联6h。[0048]用乙醇沉淀染色质DNA，酚氯仿纯化后用于Real-time定量PCR检测。[0049]结果：用27kDaY-醇溶蛋白基因启动子的引物和泛素启动子的引物分别进行定量PCR检测，结果显示27kDay-醇溶蛋白基因启动子在ZmbZIP22抗体免疫沉淀的材料中比在IgG免疫沉淀的材料中有明显的富集，而泛素启动子在上述材料中均无富集。说明ZmbZIP22能够在体内结合27kDay-醇溶蛋白基因启动子图2。[0050]实施例三:ZmbZIP22对27kDaY-醇溶蛋白基因启动子的转录激活采用双荧光转录激活系统检测ZmbZIP22对27kDay-醇溶蛋白基因启动子的转录激活，策略示意图如图3。[0051]1•通过111和33^I酶点将靶标基因启动子连入融合荧光素酶基因的报告载体pGreen-〇8〇0中，将转录因子ZmbZIP22开放阅读框连入35S启动子驱动的效应载体中。[0052]2•将载体通过热激法转入农杆菌菌株GV3101中。[0053]3.通过农杆菌侵染烟草叶片细胞瞬时表达报告载体和效应载体所携带的蛋白。[0054]4.48h后抽提侵染后的叶片蛋白。[0055]5•采用全波长荧光检测仪TECAN检测萤火虫荧光素酶酶活。[0056]6.将萤火虫荧光素酶反应终止，检测海肾荧光素酶酶活。[0057]7•计算两次酶活的比值，获得转录激活数据。[0058]结果:经过计算ZmbZIP22组相比负对照组，荧光素酶酶活比值显著较高（图4。说明ZmbZIP22能够显著地激活27kDay-醇溶蛋白基因启动子。[0059]实施例四：构建ZmbZIP22的CRISPR-Cas9转基因载体，并用于转基因转化。[0060]选取本实验室之前已经构建完毕的适用于玉米的CRISPR-Cas9载体作为农杆菌转化玉米幼胚的载体。用PstJ酶切载体，分别将合成的用于转基因的guideRNA序列连同玉米U6启动子和终止子插入到载体中（图5。并且电击转化EHA105菌株。选取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程：1•农杆菌侵染lOmin-共培养20°C3天。[0061]2•恢复培养28°C7天-筛选培养双丙氨磷1.5mgl28°C14天。[0062]3•筛选培养双丙氨磷31^128。〇14天3-5轮。[0063]4•获得抗性愈伤组织-暗再生培养28°C14-21天。[00M]5.光再生培养28°C14-21天-获得阳性苗。[0065]6•移入盆中，授粉并获得后代。[0066]结果:选取1000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得10个转基因阳性事件。获得后对各个事件进行鉴定，通过TPS法抽提各事件植株的基因组，并针对guideRNA序列所在基因组的位置，设计跨越guideRNA序列PCR引物，扩增得到目的片段后进行TA克隆，挑选阳性克隆进行测序，获得了具有移码突变形式的9号和10号事件（图6。扩繁保种，用于获得纯合突变体并进行下游分析。证明转基因突变体材料成功获得。[0067]实施例五:的转基因移码突变材料中ZmbZIP22表达情况的检测1.取未成熟籽粒8-10颗。[0068]2.去种皮和胚后鉴定TPS法鉴定基因型。L〇〇69]3•分别抽提移码突变的ZffibZIP突变体材料和野生型材料总蛋白。使用液氮研磨胚乳达到粉末级，取研磨后的籽粒胚乳粉末装入EP管中，加入IP裂解液，冰上裂解20min。[0070]4.离心，取上清。两个样品各取如1的蛋白，加入hi混有1MDTT的5XSDS蛋白上样缓冲液，99°C变性10分钟后，立即将蛋白样品插在冰上。[0071]5•SDS-PAGE电泳，堆积胶为5%，80V电泳半小时后，分离胶为12•5%，电泳时间约为2小时。[0072]6.200raA转膜lh。用TBS頂S置5%牛奶室温封闭lh。[0073]7•用ZmbZIPM抗体和Tubulin抗体Sigma以11000比例稀释在5%牛奶中。室温杂交lh。[0074]8_TBST洗膜6次，每次5min。[0075]9.用相应二抗室温杂交lh。[0076]10.TBST洗膜6次，每次5min。[0077]11•加入显色底物，用TAN0N化学发光成像仪现象。[0078]结果显示内参Tubulin在两种材料中都存在，而ZmbZIP22仅存在于野生型基因型的材料中（图7，说明Cas9转基因移码突变体是ZmbZIP22缺失突变体。[0079]实施例六:ZmbZIP22的Cas9缺失突变体中27kDa丫-醇溶蛋白转录情况检测1.取未成熟籽粒8-10颗。[0080]2•去种皮和胚后鉴定TPS法鉴定基因型。[0081]3•分别用TIANGEN植物多糖多酚总RNA抽提试剂盒抽提移码突变的Z—ZIP突变体材料和野生型材料总RNA。[_2]4.用T0Y0B0反转录试剂盒进行RNA的反转录。[0083]5.以泛素基因为内参，SYBRGreen探针相对定量法检测27kDaY-醇溶蛋白基因的转录情况。[0084]结果显示，相对与野生型，27kDay-醇溶蛋白基因在突变体中的转录下降了超过25%图8。[0085]实施例七：ZmbZIP22基因编辑缺失突变体籽粒中醇溶蛋白的SDS-PAGE检测1•将籽粒去皮去胚，剩下胚乳待用。[0086]2.使用液氮研磨胚乳达到粉末级。[0087]3.取研磨后的籽粒胚乳粉末装入EP管中，放入冷冻干燥机中，冷冻抽千。[00SS]4.取50mg冷冻抽千的籽粒胚乳粉末装入EP管中，加入iml石油醚，涡旋混匀后，摇床室温孵育1小时。[0089]5.12,000rpm，离心15分钟，弃上清。[0090]6•再加入lml石油醚，幹旋混匀后，12，OOOrpm，离心15分钟，弃上清。[0091]7•得到的沉淀放入冷冻干燥机中，冷冻抽干。[0092]S•加入lml硼酸钠缓冲液，2〇yl巯基乙醇。斡旋混匀后，置于37度恒温摇床中，孵育过夜12小时）。[0093]9_12,000印111，离心15分钟，移取上清大约90^1至新管中，上清液则为总蛋白。[0094]10•取300yl总蛋白溶液，加入7〇Oyl无水乙醇，斡旋混匀，摇床室温孵育2小时。[0095]11•12，〇〇〇rpm，离心15分钟，吸取全部上清至新管中，上清液则为醇溶蛋白，沉淀为非醇溶蛋白。[0096]12•用70%的乙醇洗沉淀两次，12,000rpm，离心5分钟。风干至边缘透明且管中没有乙醇味后，加入200U1IPG溶液后，弹匀溶解。[0097]13.上清液放入冷冻干燥机中，冷冻抽干，加入200ulIPG溶液后，弹匀溶解。[0098]14•取300nl总蛋白溶液，放入冷冻干燥机中，冷冻抽干，加入200ulIPG溶液后，弹匀溶解。[0099]15•各取4yl的溶解的总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白，加入liil混有1MDTT的5XSDS蛋白上样缓冲液，99°C变性10分钟后，立即将蛋白样品插在冰上。[0100]16•SDS-PAGE电泳验证，堆积胶为5%，80V电泳半小时后，分离胶为12.5%，电泳时间约为2小时。[0101]17.取下蛋白胶，放入考马斯亮蓝中摇床室温染色4小时，使用脱色液脱色，至背景透明，使用Bio-Rad电泳成像仪拍胶。[0102]18.完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至lOOul，使终浓度为0.5mgml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用〇.9%NaCl或PBS稀释标准品。[0103]19.将标准品按0,1，2,4,8，12，16,20ul加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20iil。[0104]20•加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20ul。[0105]21•各孔加入200ulG250染色液，室温放置3-5分钟。[0106]22•用酶标仪测定A595，或560-61Onm之间的其它波长的吸光度。[0107]23.根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。[0108]结果:醇溶蛋白在基因编辑突变体籽粒中出现显著的下降，非醇溶蛋白略有上升图9dTkDay-醇溶蛋白的含量在基因编辑突变体籽粒中出现显著的下降（图10。[0109]实施例八:透射电镜观察籽粒细胞形态1.取材和固定:一般样品块的大小约为1立方毫米，取材完成后立即放入2.5%戊二醛的固定液中，真空栗抽气两到三次，每次2min不要让固定液溅出）。然后用PBS缓冲液清洗3次，每次20分钟，换蒸馏水洗三次，每次30分钟；用1%锇酸（用蒸馏水配制在室温下固定1.5小时，用蒸水清洗三次，每次30分钟。[0110]2•脱水：用50%、60%、70%、85%、95%、100%的乙醇分别浸溃固定的材料，每种浓度处理10〜15min。[0111]3.置换树脂：①在管瓶中加入2ml无水乙醇和lml丙酮，处理材料lOmin。[0112]②向管瓶中追加lml丙酮，处理材料10min。[0113]③向管瓶中再追加2ml丙酮，处理材料l〇min。[0114]④倾倒出管瓶中的无水乙醇和丙酮混合液，加入纯丙酮3次，每次10min。[0115]4•浸透：用丙酮：epon812树脂以2:1，1:1和1:2进行渗透，每次4小时，再用纯包埋剂印on812树脂渗透三次，第一次过夜，后两次每次6小时。[0116]5.包埋与聚合:在包埋模的两端放上已浸透的材料（用牙签将样品挑出管瓶），用滴管吸取新配制的树脂，并注满每个穴孔，用牙签拨样品，使样品按一定方位有利修块、切片和观察排列，做好记载，在4〇°C，50°C和60°C各聚合12h。[0117]6•包埋块经过修块后，在Leica超薄切片机上切取超薄切片，切片厚度为60-80nm;将超薄切片捞在覆有Forwever膜的铜网上。[0118]7•捞在铜网上的超薄切片直接用于染色。先用醋酸双氧铀染色20分钟，用蒸馏水漂洗五次，每次10分钟。再用柠檬酸铅染色20-30分钟，用蒸馏水漂洗五次，每次10分钟。用滤纸吸千铜网上的水分，放入铜网盒中千燥保存。[0119]8•Hitachi-7650Japan透射电子显微镜观察，并拍照保存。[0120]结果:从图11的透射电镜结果中可以看到，部蛋白体在突变体籽粒中出现外壳变薄并且不规则的现象。[0121]实施例九:酸水解法测总氨基酸1.精确称取适量试样如30.OOmg，放入水解管瓶中。[0122]2•加入5mL6molL优级纯盐酸和0_02mL重蒸苯酚，充高纯氮气5分钟，封口，将水解管瓶置110°C恒温干燥箱中水解22小时。[0123]3.水解结束后冷却至室温，将水解液过滤并定容，混匀，取适量滤液于5f5°C氮气吹千或减压干燥。[0124]4•用适量〇.〇2m〇lL优级纯盐酸充分溶解混匀，0.45mt滤膜过滤收集续滤液。[0125]5•用L-8900全自动氨基酸分析仪进行测定。[0126]结果:经测定，常规玉米欠缺的赖氨酸和甲硫氨酸在基因编辑的突变体中均有显著上升图12。说明突变体的蛋白质品质确实得到了提升。

权利要求：1.一种玉米转录因子ZmbZIP22,其特征在于该转录因子具有SEqidN0:1所示的碱基序列。2.—种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述转录因子ZmbZIP22的序列。3.根据权利要求2所示的载体，其特征在于该载体是ZmbZIP22的CRISPR-Cas9转基因载体。4.一种根据权利要求1所述的转录因子ZmbZIP22在调控玉米籽粒储藏蛋白27kDay-醇溶蛋白中的应用。5.—种根据权利要求1所述的转录因子ZmbZIP22在结合并转录激活27kDay-醇溶蛋白的启动子中的应用。6.—种转录因子ZtnbZIP22转基因CRISPR-Cas9表达载体的构建方法，其特征在于采用PC4MBL433W为转基因载体，将SEQIDN0:2所示序列作为gRNAspacer和scaffold连入PG4MBL4330J转基因载体中获得，其中载体经过改造，以玉米U6启动子和终止子表达gRNA，同时以玉米泛素启动子和N0S终止子表达玉米密码子优化的Cas9蛋白。7.—种玉米转录因子ZmbZIP22基因突变后在农业高品质玉米育种方面的应用，其特征在于醇溶蛋白含量的下降、赖氨酸和甲硫氨酸含量的上升而导致的籽粒蛋白质品质的提升。

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