买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明提供一种花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro，其序列如SEQIDNO:1所示。该启动子序列从玉米基因组中克隆得到，能够驱动目的基因在单子叶玉米花丝和双子叶植物雌蕊中特异表达。本发明还包括利用该启动子驱动目的基因在雌蕊或花丝组织中表达，从而提高植物对病原菌的抗性或产生雌性不育植物。

主权项：1.花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

全文数据：花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro及其应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学、生物信息学、基因工程技术领域，具体地说，涉及一种花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro及其应用。背景技术[0002]花丝是玉米雌性生殖器官的一部分。它是附着在子房上的长长的毛状结构，与典型开花植物雌蕊的柱头和花柱功能相同。花丝负责捕捉和选择亲和的花粉粒，花粉粒在花丝上生长，萌发，花粉管顺着表皮毛生长到花丝中，到达胚珠。先前的研究表明花粉中的营养物质只够支持花粉管沿着花丝增长2厘米Heslop-Harrisonetal，1984，而花粉管的继续生长需要由花丝提供足够的营养和适当的信号支持。[0003]花丝的生长发育直接关系着授粉受精过程，与花粉的粘附、水合作用和萌发有密切关系。为了完成这些独特的生理过程，玉米花丝必须要表达一些相关基因，而这些基因大多是花丝特异或者主要在花丝中表达。[0004]在双子叶植物中已经分离到一些主要在柱头中作用的基因和启动子。其中包括来自NicotianaalaraAtkinsonetal，1993的蛋白酶抑制剂基因，来自矮牵牛的几丁质酶基因（Leung,1992，以及参与了油菜自交不亲和系统的基因（Dzelzkalnsetal，1993;Goringetal，1993;NasrallahandNasrallah，1993;TrickandHeizmann,1992。[0005]美国专利No.5633441中公开了一种以柱头特异型“STMG，sty1e_stigma3口6^；1^3”基因为基础，构建由？511^启动子驱动13；1：1^36、木瓜蛋白酶或1?熟86基因的表达载体来制备雌性不育植物的方法。美国专利No.5767374也公开了通过转化由柱头特异启动子驱动编码雌性不育相关蛋白的外源DNA获得雌性不育植物的方法。然而，专利No.5633441和No.567374中都没有涉及花丝特异启动子或它们的应用。[0006]上述启动子都是从双子叶植物中分离出来，并不清楚这些启动子是否能在玉米等单子叶植物中发挥特异性作用。利用转录组分析，从玉米中鉴定出1，427个基因特异的或主要在花丝中表达，生物信息学分析显示这些基因不仅包括授粉途径所需的基因，其中很多基因涉及编码氨基酸转运蛋白，多肽和寡肽转运蛋白以及富含半胱氨酸受体激酶类蛋白Xuetal，2012。但有关玉米花丝特异启动子的报道很少，Tao等分离到一个玉米花丝特异基因zmgrp5,编码一个187氨基酸富含甘氨酸的蛋白质。瞬时表达分析显不基因5端1，779bp的核苷酸序列可以驱动报告基因GUS在花丝中表达，在叶片中不表达。转化拟南芥的结果发现zmgrp5启动子驱动报告基因GUS主要在柱头中表达，在花瓣的维管束中有微弱表达Taoetal，2006。美国专利此.6515204中公开了该启动子03的功能。[0007]花丝特异启动子在生产上有重要的应用价值。利用花丝特异性启动子驱动不育相关基因在花丝中表达，可以产生雌性不育植株。雌性不育在遗传育种和制种等方面有一定作用，可以有效防止自花传粉等。例如，利用水稻雌性不育突变体为父本，与恢复系杂交，@过轮回杂交、高代纯合，筛选出雌性完全不育的新型恢复系。基于该恢复系与雄性不育系母本混播制种，不仅可以提高制、繁种产量和确保所产杂交种子的纯度，而且可完全实现杂交水稻种子的机械化生产高荣村等，2009。从而提高杂交稻种子的生产规模，降低种子生产成本。[0008]花丝特异性启动子还可以用于提高玉米的抗病性。花丝是玉米中镰刀菌Fusariumgraminearum等真菌入侵的主要途径之一。真菌孢子在花丝上生长，萌发，菌丝在花丝内部或外部向下生长，直到它们侵染到胚珠。利用花丝特异性启动子，在花丝中表达某些防御基因可能会增加玉米对镰刀菌等真菌的抗性。发明内容[0009]本发明的目的是提供一种花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro。[0010]本发明的另一目的是提供启动子ZmbZIP25pro序列在植物基因工程中用于驱动目的基因在玉米花丝或植物雌蕊柱头中特异表达，从而提高转基因植物的抗病性或获得雌性不育的植物中的应用。[0011]为了实现本发明目的，本发明的花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro,其核苷酸序列为：[0012]iSEQIDN0:1所示的核苷酸序列;或[0013]iiSEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列;或[0014]iii在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1XSSPE或含0•1%SDS的0.1XSSC溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜;或[0015]iv与i、ii或iii的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。[0016]发明人从玉米自交系Mol7中克隆了花丝特异表达基因ZmbZIP25的启动子序列，长度为2450bp，启动子ZmbZIP25pro在植物雌蕊，尤其是花丝或柱头中特异表达。[0017]本发明还提供表达盒、表达载体或克隆载体，其包括包含如SEQIDNO:1所示序列的核酸。[0018]本发明还提供工程菌、转基因细胞系，其含有所述启动子ZmbZIP25pro、或所述表达盒或载体。[0019]本发明还提供启动子ZmbZIP25pro在调控下游基因表达中的应用。[0020]所述下游基因包括雌性生育力相关基因、抗病相关基因、荧光报告基因、GUS基因。[0021]本发明还提供所述启动子ZmbZIP25pr〇在制备转基因植物中的应用。[0022]所述植物是自花授粉或异花授粉植物，可以是单子叶和双子叶植物，包括但不限于玉米、拟南芥。[0023]在本发明的一个具体实施方式中，将ZmbZIP25pr〇启动子序列与目的基因（如GFP连接，构建表达载体，转化玉米，ZmbZIP25pro启动子驱动该目的基因特异地在玉米花丝中表达，而在其他组织中不表达。[0024]在本发明的另一个具体实施方式中，将ZmbZIP25pro启动子序列与目的基因（如GUS连接，构建表达载体，转化拟南芥，ZmbZIP25pr〇启动子驱动该目的基因特异地在拟南芥柱头中表达，而在检测的幼苗、根、茎、叶和其他花组织中均不表达。[0025]本发明进一步用于PCR扩增所述启动子ZmbZIP25pro的特异性引物，包括：[0026]bZIPp-Fl:5'-GAATTCTGCTGAGGAGGAGGAAGT-3'[0027]bZIPp-R:5，-ACTAGTCCTGCTGTGAGGGTGAGGCTAT-3，。[0028]本发明从玉米基因组中克隆了花丝特异表达基因的启动子序列，该启动子序列与不同目的基因连接构建表达载体，转化受体植物，可使目的基因只在植物雌蕊包括花丝、柱头）中表达。可将其用于在植物雌蕊细胞中特异性表达外源基因，从而提高植物对病原菌的抗性或产生雌性不育植物。[0029]与美国专利此.6515204中的03启动子相比，211*21?25?1〇具有更强的组织特异性，C3启动子驱动的GUS基因除了在转基因拟南芥的柱头中表达外，在花瓣和雄蕊的维管束中也检测到微弱表达，组织特异性不强，而ZmbZIP25pro驱动的GUS基因仅在转基因拟南芥柱头顶端表达。附图说明[0030]图1为本发明实施例1中RT-PCR分析ZmbZIP25基因在玉米中表达模式。[0031]图2为本发明实施例3中表达载体pbZIPP2450-GFP的构建示意图。[0032]图3为本发明实施例4中瞬时表达分析启动子bZIPP2450在玉米不同组织中的活性。[0033]图4为本发明实施例6中表达载体p1391-bZIPP2450-GUS的构建示意图。[0034]图5为本发明实施例7中转化pl391-bZIPP2450拟南芥PCR鉴定结果。其中，1-6为pl391-bZIPP2450转化拟南芥PCR鉴定结果，7为非转基因对照，M为DL2000PlusMaker。[OO35]图6为本发明实施例8中启动子bZIPP2450驱动GUS基因在转基因拟南芥柱头中表达，Ti代转基因拟南芥不同组织⑶S组织化学染色分析结果。其中，A:幼苗，B:叶片，C:花，方框所示为GUS表达部位。具体实施方式[0036]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJRussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。[0037]实施例1RT-PCR分析ZmbZIP25基因在玉米中表达模式[0038]从MaizeGDBhttp:www.maizegdb.org的转录组数据库中发现一个花丝特异表达基因GRMZM2G〇8〇731，其编码的蛋白具有bZIP结构域，因此命名为ZmbZIPSSJrizol法提取玉米自交系B73幼苗、根、茎、叶、授粉后的雌穗、雄穗、气生根、种子和花丝中总RNA，以OligodT为引物反转录合成cDNA第一条链。设计RT-PCR扩增引物，bZIP25-F:CGACCAGCAGCCAAACTCTA和bZIP25-R:AATCCGCCCAGCCACATAM。以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应条件:95°C,30s;60°C,30s，72°C，30s，30个循环。[0039]PCR结果显示，ZmbZIP25基因只在花丝中表达，而其它组织中都未检测到ZmbZIP25的表达图1。[0040]实施例2玉米花丝特异启动子序列ZmbZIP25pro的克隆[0041]根据玉米自交系Mol7基因组序列，设计引物，扩增ZmbZIP25基因上游的调控序列。引物序列为bZIPp-F1:GAATTCTGCTGAGGAGGAGGAAGT含EcoRI位点），bZIPp-R:5'-ACTAGTCCTGCTGTGAGGGTGAGGCTAT-3含SpeI位点）。以Mol7基因组DNA为模板，PCR反应程序：95°C5m;98°C20s，68°C30s，72°C120s，8个循环；98T：20s，57.5°C30s，72°C120s，30个循环。扩增产物为2450bp，长度与预期相符，回收目的片段，与T载体pMD-19T连接，转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒p19T-bZIPP2450。测序结果表明克隆的bZIPP2450序列正确即ZmbZIP25pro,序列见SEQIDN0:1。利用PlantCARE网站（http:bioinformatics.psb.ugent.bewebtoolsplantcarehtml，分析克隆的2450bp片段中潜在的植物DNA顺式作用元件，结果表明该片段中存在包括CATT-motif，CMT-box等多种推测的调控元件，但缺乏启动子区的特征序列TATA-box。[0042]实施例3表达载体pbZIPP2450-GFP的构建[0043]设计启动子正向引物bZIPp-F2:GATATCTGCTGAGGAGGAGGAAGT含EcoRV位点），以质粒pl9T-bZIPP2450为模板，用引物bZIPp-F2和bZIPp-R进行PCR扩增，扩增的启动子片段连接到T载体PMD-19T上。测序验证后，用EcoRV和SpeI双酶切重组质粒，电泳回收启动子片段。同时，用PstI酶切质粒p35SGFP，Klenow酶补平末端，再用SpeI酶切，回收载体片段，与启动子连接，构建表达载体pbZIPP2450-GFP，载体示意图见图2。[0044]实施例4基因枪法转化玉米组织[0045]基因枪转化方法参照Wang等方法WangD，ZhaoQ，ZhuD，AoG，YuJ.Particle-bombardment-mediatedco-transformationofmaizewithalysinerichproteingenesb401frompotato•Euphytica•2006，150:75-85•，取玉米叶片和苞叶切成小片，未授粉的幼穗切成薄片，花丝切成段，授粉后12天的幼穗剥出幼胚，所有受体材料都置于MS固体培养基上，用重组质粒pbZIPP2450-GFP和对照质粒p35SGFP分别制备基因枪子弹，轰击受体材料，射击参数:Gapdistance:20mm;微弹载体飞行距离Macroprojectileflightdistance:10mm;微弹飞行距离（Particleflightdistance:7cm;压力：1350psi;真空度：25inchesHg。[0046]实施例5瞬时表达分析启动子bZIPP2450在玉米不同组织中的表达活性[0047]基因枪转化16-20小时后，用奥林巴斯体式荧光显微镜观察GFP的表达，激发光波长为488nm。在转化了P35SGFP的不同玉米组织中都观察到GFP荧光，而在转化了PbZIPP2450-GFP的玉米材料中，只在花丝中观察到GFP荧光，其它组织中没有观察到（图3，结果重复了3次。[0048]实施例6表达载体P1391-bZIPP2450_JUS的构建和拟南芥转化[0049]用EcoRI和SpeI双酶切质粒p19T-bZIPP2450,电泳回收启动子片段，回收片段插入到载体PCAMBIA1391的GUS基因前面（载体示意图见图4，构建表达载体pl39hbZIPP2450-GUS。[0050]利用电击法将构建的植物表达载体pl391-bZIPP2450-GUS转入农杆菌GV3101菌株。具体转化方法为:将lug质粒加入到50ul农杆菌GV3101感受态细胞中，轻轻混匀后，转到冰上预冷的电击杯中。将电击杯外壁的水擦干，进行电击。将预冷的lmlYEB液体培养基加入到电击杯中，混匀后，全部吸到Eppendorf管中。28°C，200rpm,摇菌2h。在含有卡那霉素100mgl和利福平（lOOmg1的YEB固体培养基上筛选农杆菌转化子。用PCR检测为阳性的农杆菌转化拟南芥，转化方法为蘸花法。收取转化后的拟南芥种子，在含25mgL潮霉素B的MS培养基上筛选阳性植株。[0051]实施例7转基因拟南芥的筛选和分子检测[0052]提取潮霉素抗性植株叶片基因组DNA，利用ZmbZIP基因启动子特异引物bZIPp-F和bZIPp-R进行PCR检测，转入外源基因的拟南芥植株可以扩增出2450bp的目的条带，而非转基因植株则无相应条带。从72棵潮霉素抗性植株中随机抽取30株进行PCR检测，其中27株检测结果为阳性。部分检测结果如图5所示。[0053]实施例8转基因拟南芥GUS活性的组织化学分析[0054]GUS活性的组织化学分析方法参考Bradford方法（Bradford丽，Arapidandsensitivemethodforthequantificationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalBiochem.,1976,72:248-2¾.。将待检测的植物材料加入GUS染色液中（50mM磷酸钠缓冲液PH7.0，0.5mMK3[FeCN6]，0.5raMK4[FeCN6]，10mMmTA，0.5mgmlX-Gluc，37°C保温数小时或过夜;叶片等绿色材料用70%乙醇脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色；肉眼或显微镜观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达部位。[0055]从pl391-bZIPP2450转化拟南芥PCR鉴定结果为阳性的27棵植株中选出10株进行GUS组织化学染色，结果显示，只在拟南芥柱头上检测到GUS活性，而拟南芥幼苗、成熟植株的叶片和花的其他部位均未检测到GUS活性图6。[0056]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。[0057]参考文献[0058]Atkinson,A.H.,Heath,R.L.,Simpson,R.J.,Clarke,A.E.,Anderson,M.A.1993.ProteinaseinhibitorsinNicotianaalatastigmasarederivedfromaprecursorproteinwhichisprocessedintofivehomologousinhibitors.PlantCell5:203-213.[0059]Dzelzalns’V.A.，Thorsness，M.K.，Dwyer，K.G.’Baxter,J.S.，Balent，M.A.，Nasrallah,M.E.,Nasrallah,J.B.1993.Distinctcis-actingelementsdirectpistil-specificandpollen-specificactivityoftheBrassicaSlocusglycoproteingenepromoter.PlantCell5:855-863.[0060]Goring,D.R.,Glavin,T.L.,Schafer,U.,Rothstein,S.J.1993.AnSreceptorkinasegeneinself-compatibleBrassicanapushasa1-bpdeletion.PlantCell5:531-539.[0061]Heslop-HarrisonY,RegerBJ,Heslop-HarrisonJ?1984.Thepollen-stigmainteractioninthegrasses.TissueorganisationandcytochemistryofthestigmaKsilk，?ofZeamaysL.ActaBotNeerl33:81-99.Leung,D.ff.M.1992.Involvementofplantchitinaseinsexualreproductionofhigherplants.Phytochemistry313:1899-1900.[0062]Nasrallah’J.B.，Nasrallah，M.E.1993.Pollen-StigmaSignalingintheSporophyticSelf-IncompatibilityResponse.Plantcell5:1325-1335.[0063]TaoTY,0uelletT,DadejK,MillerSS,JohnsonDA,SinghJ.2006.Characterizationofanovelglycine-richproteinfromthecellwallofmaizesilktissues.PlantCellRep.25⑻：848-58.[0064]Trick,M.,Heizmann,P.1992.Sporophyticself-incompatibilitysystems:BrassicaSgenefamily.Int.Rev.Cytol.140:485-524.[0065]XuXH,ChenH,SangYL,ffangF,MaJP,GaoXQ,ZhangXS.2012Identificationofgenesspecificallyorpreferentiallyexpressedinmaizesilkrevealssimilarityanddiversityintranscriptabundanceofdifferentdrystigmas.BMCGenomics.13:294.doi:10.11861471-2164-13-294.[0066]高荣村，姜程曦，魏晓星，陆金根，李金军，（2009水稻雌性不育突变体研宄进展及应用展望。浙江农业科学，5:853-855。

权利要求：1.花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro,其特征在于，其核苷酸序列为：iSEQIDN0:1所示的核苷酸序列;或iiSEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列;或iii在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含〇•1%SDS的0•1XSSPE或含0•1%SDS的0•1XSSC溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜;或iv与i、ii或iii的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。2.表达盒、表达载体或克隆载体，其包括包含如权利要求1中所示序列的核酸。3.含有权利要求1所述启动子ZmbZIP25pro、权利要求2所述表达盒或载体的工程菌。4.权利要求1所述启动子ZmbZIP25pro在调控下游基因表达中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述下游基因包括雌性生育力相关基因、抗病相关基因、荧光报告基因、GUS基因。6.权利要求1所述启动子ZmbZIP25pro在制备转基因植物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物是自花授粉或异花授粉植物，包括玉米、拟南芥。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将ZmbZIP25pr〇启动子序列与目的基因连接，构建表达载体，转化玉米，ZmbZIP25pr〇启动子驱动该目的基因特异地在玉米花丝中表达。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将ZmbZIP25pro启动子序列与目的基因连接，构建表达载体，转化拟南芥，ZmbZIP25pro启动子驱动该目的基因特异地在拟南芥柱头中表达。10.用于PCR扩增权利要求1所述启动子ZmbZIP25pro的特异性引物，其特征在于，包括：bZIPp-F1:5'-GAATTCTGCTGAGGAGGAGGAAGT-37bZIPp-R:5，-ACTAGTCCTGCTGTGAGGGTGAGGCTAT-3，。

百度查询： 中国农业大学 花丝或柱头特异启动子ZmbZIP25pro及其应用