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申请/专利权人：中山大学中山眼科中心

摘要：本发明涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明基于Sanger测序的原理，具有高度的敏感性、稳定性和准确性的特点，可以同时检测LHONmtDNA最常见的四个致病突变，解决了现有检测LHON线粒体DNA突变方法的灵敏度低和特异性不够强、容易污染和费用昂贵等问题，为LHON提供了一种精准的基因诊断方法，对该病的遗传咨询和基因治疗有重要意义。

主权项：1.一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MT-ND4-F：5’-GCCTACCCCTTCCTTGTACT-3’，MT-ND4-R：5’-TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT-3’；MT-ND6-F：5’-GTTTACCACAACCACCACCC-3’，MT-ND6-R：5’-AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG-3’；MT-ND1-F：5’-GGCCAACCTCCTACTCCTC-3’，MT-ND1-R：5’-TGATGGCTAGGGTGACTTCA-3’。

全文数据：一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法技术领域：[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法。背景技术：[0002]Leber遗传性视神经病变（Leber’shereditaryopticneuropathy，LH0N是最常见的线粒体遗传病之一，也是青壮年视力丧失的最常见原因之一[ManPYWetal.JMedGenet，2002]。95%以上的患者是由线粒体DNAmtDNA的3个原发致病突变引起，包括位于MT-ND4基因的m.11778GA，MT-ND6基因的m.14484TC以及MT-ND1基因的m.3460GA[CerelliVetal.ProgRetinEye1^8,2004]。而位于]\〇'-冊1基因的111.36356厶突变是中国人群中第4个常见突变，其突变频率与m.3460GA突变相当[JiaXYetal.JHumGenet，2006]。通过对这4个位点进行突变检测，对于这种严重影响青壮年视力疾病的早期诊断、干预、和治疗具有重要意义。[0003]目前，一方面，市场上没有商品化的LH0N常见mtDNA4位点突变检测试剂盒；另一方面，LH0N的基因诊断最常见的方法有等位基因特异性PCRAS-PCR[CN1288254C，CN102146443A，CN101781683A]、限制性片段长度多态性（RFLP[CN1143117A，CN102747152A，CN104774927A，CN103173545A，CN104774926A，CN103173544A]以及等位基因特异性荧光探针技术?〇?[0附7218394,0附7125434]，检测单个或者3个常见突变位点，这些检测方法都具有简便、快速、费用低的优点，但是由于mtDNA变异在人群中发生频率高，位于原发突变邻近区域的变异会影响结果，造成假阳性或假阴性，此外，还有芯片检测法[CN101497925A，CN104805210A]，可以同时检测更多LH0N相关mtDNA变异，具有准确高通量的优点，但是该方法费用昂贵。发明内容：[0004]本发明的目的是提供一种具有高度的敏感性、稳定性和准确性的Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物、试剂盒和检测方法。[0005]本发明的第一个目的是提供Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：[0006]MT-ND4-F:5’-GCCTACCCCTTCCTTGTACT-3’（如SEQIDNO.1所示），MT-ND4-R:5’-TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT-3’（如SEQIDNO•2所示）；MT_ND6_F:5’-GTTTACCACAACCACCACCC-3’（如SEQIDN0.3所示），MT_ND6-R:5’-AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG-3’（如SEQIDN0.4m*;MT-NDl-F:5’-GGCCAACCTCCTACTCCTC-3’®nSEQIDN0.5K*，MT-NDl-R:5’-TGATGGCTAGGGTGACTTCA-3’®nSEQIDN0.6m*。[0007]本发明的第二个目的是提供Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括上述的检测引物。[0008]优选，所述的检测试剂盒还包括2*MasterMix、ddH2〇、阳性质控品和阴性质控品。[0009]所述的阳性质控品为含有SEQIDNO.8序列的质粒DNA、含有SEQIDNO.10序列的质粒0嫩、含有5£〇10从.12序列的质粒0嫩和含有5£〇10从.13序列的质粒0嫩。[0010]所述的阴性质控品为不含有SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12和SEQIDNO.13序列的DNA序列。[0011]本发明的第三个目的是提供Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1提取待测样品的基因组DNA;2用检测引物MT-ND4-FMT-ND4-R、MT-ND6-FMT-ND6-R和MT-ND1-FMT-ND1-R分别对步骤⑴提取的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；（3对PCR扩增产物进行测序，然后与野生型线粒体DNA相应的基因序列进行比对，确定是否存在基因突变位点。[0012]所述的测序的方法优选为Sanger测序法。[0013]Sanger测序原理，DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸三磷酸dNTP存在下进行复制时，在反应体系中分别按照一定的比例引入四种荧光染色剂标记的双脱氧核苷三磷酸ddNTP。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-0H基团，当ddNTP掺入链的末端时，该链就会停止延伸。如此每管反应体系中就产生了一系列长度不等的以ddNTP为3’端的DNA片段。反应终止后，在毛细管中进行凝胶电泳以分离长短不一的DNA片段，相邻的片段长度相差一个碱基，在毛细管电泳中的迀移率就不同，激光检测器可对荧光分子逐个进行检测，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。[0014]所述的PCR扩增的反应体系为:包含基因组DNA20ng、2*MasterMix10此、10虚上游引物0.3yL和10yM下游引物0.3yL，其余由双蒸水补足至20yL;PCR扩增的反应程序为:94°C，预变性5min;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，重复30个循环；72°C延伸5min。[0015]本发明基于Sanger测序的原理，具有高度的敏感性、稳定性和准确性的特点，可以同时检测LH0NmtDNA最常见的四个致病突变，解决了现有检测LH0N线粒体DNA突变方法的灵敏度低和特异性不够强、容易污染和费用昂贵等问题，为LH0N提供了一种精准的基因诊断方法，对该病的遗传咨询和基因治疗有重要意义。具体实施方式：[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。[0017]实施例1:检测引物的设计和标准品的制备[0018]1、检测引物的设计[0019]根据NCBI数据库中mtDNA中的MT-ND4基因（GeneBank序列号为GeneID:4538;NC_012920.1;YP_003024035.1、MT-ND6基因（GeneBank序列号为GeneID:4541;NC_012920.1;YP_003024037.1和MT-ND1基因（GeneBank序列号为GeneID:4535;NC_012920.1;P_003024026.1的核苷酸序列，分别在G11778A突变位点、T14484C突变位点、G3460A和G3635A两个突变位点的上下游设计检测引物。所设计的检测引物如表1所示。[0020]表1检测引物序列[0021][0023]2、标准品的制备[0024]将SEQIDN0.7和SEQID勵.8作为目的片段分别插入到口611载体的多克隆位点制备得到野生型质粒PGH-G11778G和突变型质粒pGH-G11778A，将SEQIDN0.9和SEQIDNO.10作为目的片段分别插入到pGH载体的多克隆位点制备得到野生型质粒pGH-T14484T和突变型质粒口611-1'14484：，将3£〇10勵.11、3£〇10勵.12和3£〇10勵.13作为目的片段分别插入到pGH载体的多克隆位点制备得到野生型质粒pGH-G3460G和突变型质粒pGH-G3460A以及野生型质粒PGH-G3635G和突变型质粒pGH-G3635A。其中，野生型质粒pGH-G3460G和野生型质粒口611-636356插入的目的片段均为3£〇10从.11所示的序列。[0025]实施例2:样本基因组DNA提取[0026]使用酚氯仿法或试剂盒提取法从临床样本中提取基因组DNA。基因组DNA提取的具体步骤如下：[0027]1•向EP管中proteinase-KMix20此，然后加样本200liL全血或白膜层）。[0028]2•向EP管中加200yLBufferAL缓冲液混匀充分），充分振荡混匀Mix-tex15s。[0029]3.将EP管放置于56°C水浴lOmin。[0030]4.取出EP管并短暂离心，去除EP管管盖内壁的液滴。[0031]5.加入200yL无水乙醇，用振荡器彻底混勾15s去除EP管管盖内壁的液滴）。[0032]6.将吸附柱放入收集管中，将上述所得溶液和絮状沉淀物全部小心转移到吸附柱中，盖上管盖，8000rpm离心1分钟。[0033]7.并将吸附柱放置于另一个干净的收集管中，向吸附柱中加入500yL缓冲液AW1已经加入无水乙醇），盖上管盖，SOOOrpm离心1分钟，将吸附柱放置于另一个干净的收集管中。[0034]8.向吸附柱中加入500yL缓冲液AW2已经加入无水乙醇）。盖上管盖，14000rpm离心3分钟;开盖瞭2分钟。[0035]9.将吸附柱置于一干净的1.5mL离心管内，弃除将装有流液的收集管。[0036]10.取缓冲液AE100yL垂直滴加至吸附柱中心，室温放置5分钟，8000rpm离心1分钟。[0037]11.EP管中为所提取DNA，4°C冰箱保存备用。[0038]实施例3:PCR扩增[0039]以实施例2提取的基因组DNA作为模板，分别以实施例1设计的检测引物MT-ND4-FMT-ND4-R、MT-ND6-FMT-ND6-R和MT-ND1-FMT-ND1-R进行PCR扩增。以不加模板DNA作为空白对照，野生型质粒作为阴性对照，突变位点的突变型质粒作为阳性对照。[0040]PCR反应体系为:总体系为20此，包含模板DNA2yL20ng、2*MasterMix10yL、10福上游引物0.3yL和1OyM下游引物0.3yL，其余用ddH20补足至20yL，PCR反应程序为:94°C，预变性5min;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，重复30个循环；72°C延伸5min。[0041]PCR扩增产物检测：取3yL的PCR扩增产物，在20gL琼脂糖凝胶含0.5ygmLEB，50V电泳45-60min，紫外灯下直接观察结果：检测引物MT-ND4-FMT-ND4-R、MT-ND6-FMT-ND6-R和MT-ND1-FMT-ND1-R扩增的目的片段大小分别为382bp、288bp和437bp。[0042]实施例4:PCR扩增产物的纯化[0043]使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。[0044]PCR扩增产物的纯化具体步骤如下：[0045]4.1柱平衡步骤：向吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）加入500此的平衡液BL，12,000^111〜13,400\8离心11]1；[11，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。请使用当天处理过的柱子）。[0046]4.2估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。[0047]4.3将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12，000rpm〜13,400Xg离心30_60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。注意:吸附柱容积为800yL，若样品体积大于800yL可分批加入。[0048]4•4向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW静置2-5min，12，OOOrpm〜13，400Xg离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。[0049]4.5重复操作步骤4.4。[0050]4.6将离心吸附柱083放回收集管中，12,000印111〜13,400\8离心2111111，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。收集纯化的PCR扩增产物。[0051]实施例5:目的片段的测序[0052]5.1PCR扩增产物的测序扩增[0053]使用表1中的检测引物的上游引物和下游引物分别对实施例4获得PCR扩增产物进行正向测序和反向测序扩增。[0054]测序PCR反应体系为：包含模板DNA1此、10福上游引物或下游引物0.5此、2.5XBigdye0.3yL、5XbufferlyL和ddH202.2yL，测序PCR反应程序：94°C，预变性5min;94°C变性10s，50°C延伸5s，60°C退火4min，重复29个循环。[0055]5.2测序扩增产物纯化[0056]在96孔板中加入测序反应扩增产物5yL和70%无水乙醇35此，4,000叩111离心30min;马上倒置96孔板，500rpm瞬时离心30sec，室温放置40min瞭干。[0057]5.3上机测序[0058]上机样本准备：晾干后的样品加Hi-Di去离子甲酰胺1OyL，95°C变性5min，然后马上置于冰上冷却5min。然后将样本放到测序仪的样本板基座上测序。[0059]5.4测序结果分析:导出原始数据，使用“DNAStar”软件分析，mtDNA位点11778上碱基G突变为A为11778突变阳性;mtDNA位点14484上碱基T突变为C为14484突变阳性;mtDNA位点3460上碱基G突变为A为3460为突变阳性;mtDNA位点3635上碱基G突变为A为3635突变阳性;碱基没有变异为阴性。[0060]实施例6:灵敏度检测[0061]6.1灵敏度检测[0062]分别将各突变型质粒和野生型质粒稀释至终浓度为lOngyL，然后将突变型质粒与其对应的野生型质粒按体积比0.2:9.8、0.5:9.5、1:9、1.5:8.5、2:8、3:7和4:6进行混合，配制成突变丰度为2%、5%、10%、15%、20%、30%和40%的阳性样本表2。以不同突变丰度的阳性样本作为模板，按照实施例3〜5所述的方法进行测序，结果如表3所示。[0063]表2突变质粒的质粒信息[0064][0065]表3灵敏度检测结果正反向测序）[0066][0067]注:表示正反向测序均未检出突变，++表示正反向测序均检出突变[0068]结合测序图及表3判断，本发明的检测引物的检测灵敏度为突变丰度为10%。[0069]6.2灵敏度验证[0070]合格标准:检测样品突变体基因组的突变丰度为10%的样本10次，至少9次检测结果符合检测下限，即检出率大于或者等于90%。[0071]6.3突变丰度为10%的阳性样本的检测灵敏度[0072]取LH0N最常见4位点突变位点的突变型质粒突变丰度10%，按照实施例3〜5所述的方法进行基因突变检测。检测结果如表4所示。结果显示，突变丰度为10%的各突变型质粒口611-61177844611-1'14484：4611-6346^和口611-636354阳性样本重复10次检测的检出率为100%。灵敏度验证通过。[0073]表4灵敏度验证检测结果突变丰度10%[0074][0075]实施例7:特异性测试[0076]特异性验证方法:收集10名正常人外周血白细胞提取的全基因组DNA，按实施例3〜5的方法进行测序。结果显示，10例样本均为野生型，特异性100%。[0077]实施例8:重复性测试[0078]将实施例6中的突变丰度为10%和30%的阳性样本作为模板，按照实施例3〜5的方法进行测序，重复10次，并计算其阳性率结果重复率，结果见表5。[0079]表5不同突变丰度模板的重复测序结果[0080][0081]注:++表示正反向测序均检出突变[0082]综合测序图及表5显示，以突变丰度为10%和30%的阳性样本作为模板进行测序，重复测序10次，阳性结果重复率均为1〇〇%，本发明的检测引物及PCR反应条件检测重复性好，并能对突变丰度为10%的样本实现稳定检测。[0083]实施例9:最低检测限测试[0084]分别以611778六、114484：、6346^和636354突变型基因组0嫩作为模板，按照反应终浓度为20ng20yL、10ng20yL、5ng20yL、2.5ng20yL和1.25ng20yL进行PCR扩增，各扩增体系中突变型基因组DNA的突变丰度均为100%。将突变型基因组DNA与野生型基因组DNA分别进行稀释，然后将突变型基因组DNA与其对应的野生型基因组DNA按体积比1:9进行混合，得到突变丰度为10%的阳性样本，然后按照反应终浓度为20ng20yL、10ng20yL、5ng20yL、2.5ng20yL和1.25ng20yL进行PCR扩增，各扩增体系中突变型基因组DNA的突变丰度均为10%。按照实施例3〜5的方法测序，重复20次。[0085]PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明：反应终浓度为20ng20yL、10ng20yL、5ng20yL、2.5ng20yL的阳性样本的扩增条带清晰明亮、无非特异性扩增。反应终浓度为1.25ng20yL的阳性样本的四个位点的检出率均低于95%。[0086]测序结果：突变丰度为100%、10%的20份阳性样本的正反向测序峰图均符合要求。检测结果见表6。结合测序图及表6判断，初步结果显示本发明的检测引物的最低检测限为模板反应终浓度为2.5ng20yL。[0087]表6检测结果正反向测试）[0088]

权利要求：1.一种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：MT-ND4-F:5’-GCCTACCCCTTCCTTGTACT-3’，MT-ND4-R:5’-TGGTTACTAGCACAGAGAGTTCT-3’；MT-ND6-F:5’-GTTTACCACAACCACCACCC-3’，MT-ND6-R:5’-AAGCCTTCTCCTATTTATGGGG-3’；MT-ND1-F:5’-GGCCAACCTCCTACTCCTC-3’，MT-ND1-R:5’-TGATGGCTAGGGTGACTTCA-3’。2.—种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括2*MasterMix、ddH2〇、阳性质控品和阴性质控品。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品包括含有SEQIDNO.8序列的质粒DNA、含有SEQIDNO.10序列的质粒DNA、含有SEQIDNO.12序列的质粒DNA和含有SEQIDNO.13序列的质粒DNA。5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性质控品为不含有SEQIDN0.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12和SEQIDNO.13序列的DNA序列。6.—种Leber遗传性视神经病变线粒体DNA基因突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1提取待测样品的基因组DNA;2用权利要求1所述的检测引物MT-ND4-FMT-ND4-R、MT-ND6-FMT-ND6-R和MT-ND1-FMT-ND1-R分别对步骤⑴提取的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；（3对PCR扩增产物进行测序，然后与野生型线粒体DNA相应的基因序列进行比对，确定是否存在基因突变位点。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的测序的方法为Sanger测序法。8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为:包含基因组DNA20ng、2*MasterMix10μί、10μΜ上游引物0.3yL和ΙΟμΜ下游引物0.3yL，其余由双蒸水补足至20yL;PCR扩增的反应程序为:94°C，预变性5min;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，重复30个循环;72°C延伸5min。

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