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申请/专利权人：天津科美生物技术有限公司

摘要：本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测和治疗前列腺癌PCa的方法。本发明提供了miR‑203SNAI2轴对前列腺癌的体外生物学特性的影响。具体的，在DU145和PC3细胞中表达miR‑203抑制SNAI2表达。miR‑203抑制了前列腺癌细胞的增殖、迁移、内皮细胞形成和肿瘤干细胞的形成。

主权项：1.一种利用miR-203SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法。

全文数据：一种利用miR-203SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法技术领域本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及microRNA检测和治疗前列腺癌PCa的方法。本发明提供了miR-203SNAI2轴可作为PCa的诊断和治疗靶点。背景技术前列腺癌PCa是如今全球第二常见男性癌症死亡的主要原因之一。PCa的形成和发展是多步骤的过程，包括正常前列腺上皮癌变前的病变转变，高档前列腺上皮内瘤PIN，局部侵袭性前列腺癌和远距离转移。广泛的研究表明，对特定基因包括微小RNAsmiRNAs和长非编码RNAlncRNAs的解除管制，是PCa的发病机制和进展的主要原因。尽管如此，与其他癌症相比，PCa中miRNA的表达模式和功能仍未被完全阐明，尽管有证据表明，在PCa的肿瘤发生和化疗抵抗中，miRNA表达的全球解除管制。确定miRNAs在前列腺肿瘤形成和进展中的作用机制，对我们更好地了解前列腺癌的性质有重要作用，并且有助于确定治疗干预的潜在靶点。MicroRNA是一类长度约20-24个核苷酸序列的短小非编码mRNAs，通过转录绑定3’-未翻译区3’-UTRs抑制目标基因的表达。MiRNAs参与调控包括致癌在内的多种生理和病理过程。对miRNAs的解除管制有助于多种癌症的发展，包括PCa。例如，下调PCa中的肿瘤抑制物，包括miR-101、miR-126*、miR-145、miR-146a、miR-224、miR-330、miR-34a、miR-200家族，发现与先进的临床分期、肿瘤转移和异位表达相关的致癌miRNAs包括miR-221222、miR-21、miR-141、miR-18a和miR-125b，这表明PCa进展有更高的风险。SNAI2编码了Snail家族C2H2锌指转录因子，并参与了不同癌症的发展。SNAI2作为一种转录抑制因子，通过与E-box的结合来调节与DNA的序列特异性的相互作用。该蛋白参与上皮间充质转移并控制干细胞，这揭示了这一转录因子在肿瘤转移中具有重要意义。SNAI2在包括前列腺在内的人体组织中广泛表达。在体内异种移植实验表明，SNAI2促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭，并介导了细胞周期蛋白D1诱导的肿瘤发生。PCa中SNAI2的沉默抑制了多能性基因的表达，激活了特异性的转移抑制因子。在选择的PCa细胞中，SNAI2的异位表达促进了它们的自我更新，并增加了转移潜能，使其具有高度恶性的特性。SNAI2可能是防止PCa进展的分子方法的关键目标。然而，在前列腺癌的形成和发展过程中，miRNAs与SNAI2之间的相互作用并没有得到很好的阐明。越来越多的证据表明，miR-203参与多种生理和病理过程，包括上皮分化、癌细胞增殖、转化和凋亡。有趣的是，不同的文献表明，miR-203参与GSK-3ββ-CATENINN通路。例如，AnnieZhang等人报道，miR-203抑制了与PIK3CA、p38MAPK、c-Jun和GSK-3信号信号相关的肝癌的增殖。在黑素瘤细胞，β-catenin压制转录miR-203。在本研究中，我们旨在系统地阐明miR-203SNAI2在前列腺癌中的确切作用。我们表明，miR-20SNAI2轴调控肿瘤发生，血管生成，具备干细胞能力，在前列腺癌转移可能通过调节GSK-3ββ-CATENIN信号通路。这些发现为miR-203和SNAI2在恶性细胞中的作用提供了新的见解。发明内容本发明确定了miR-203SNAI2轴在体外调节前列腺细胞的迁移。为了描述miR-203SNAI2轴在前列腺癌进展过程中的作用，我们用pSIN-miR-203转染入DU145和PC3细胞。Transwell试验的目的是探讨miR-203对前列腺癌细胞迁移的影响。如图1A-C所示，miR-203减少了DU145和PC3细胞的迁移p0.05。与只转染pSIN-miR-203p0.05相比，pSIN-miR-203和pSIN-SNAI2共同转染后细胞迁移能力增加。伤口愈合试验也显示相似的结果图1D-G。附图说明图1MiR-203SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外的迁移。A、B和C。由Boyden小室检测法在转染了pSIN-miR-203或共转染了miR-203和SNAI2的的情况下，分别测定DU145和PC3细胞迁移潜力的表达A和定量B和C。测量尺为：100μm。D、E、F和G。在感染上的pSIN-miR-203或pSIN-miR-203和pSIN-miR-203的感染，在48h后，用创面愈合试验D和E和定量的伤口面积F和G的百分率来描述。测量尺为：250μm。所有数据均通过t检验进行统计分析。不同的字母表示差异具有统计学意义p0.05。具体实施方式1.细胞培养5个前列腺癌细胞株DU145、PC3、22Rv1、LNCaP和C4-2和2个永生化和未转化的前列腺上皮细胞系PZ-HPV-7和RWPE1从美国ATCC获得。细胞按照ATCC的标准手册进行培养。人类脐静脉内皮细胞（HuVECs）购买于LifeTechnologiesCarlsbad，California，USA，根据说明书进行培养。2.半定量RT-PCR和qRT-PCR半定量RT-PCR和qRT-PCR均按之前描述进行。引物序列如下：5´-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGTG-3´specificRTprimerformiR-203，5´-GTGCAGGGTCCGAGGT-3´realtimePCR，miR-203，forward，5´-GCCGCGTGAAATGTTTAGG-3´realtimePCR，miR-203，reverse；5´-CTCGCTTCGGCAGCACA-3´realtimePCR，U6，forward，5´-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3´realtimePCR，U6，reverse。3.Transwell侵染检测细胞5×104悬浮于200μ1含1%FBS的基本培养基中并接种于transwell上室中。下室为500μl含10%FBS的培养基。孵化24h后，迁移的细胞用4%多聚甲醛固定Beyotime15min，用0.1%结晶紫染色15min，用显微镜Olympus拍照。然后用200μ1的醋酸33%，vv消除染色的结晶紫，并用ELISAreaderMoecularDevices，SunnyvaleCA，USA在OD570测量吸光值。4.伤口愈合实验处理的细胞1×106在6孔板中培养过夜。覆盖率达到到达90%时使用200μl枪头刮动细胞层，然后立即用含1%胎牛血清的生长培养基洗两次。在0、12、24和48h用显微镜捕捉这些板块的照片。

权利要求：1.一种利用miR-203SNAI2轴调节前列腺癌细胞在体外迁移的方法。2.根据权利要求1所述，其特征在于，miR-203减少了DU145和PC3细胞的迁移。3.根据权利要求2所述，其特征在于，与只转染pSIN-miR-203p0.05相比，pSIN-miR-203和pSIN-SNAI2共同转染后细胞迁移能力增加。4.根据权利要求2所述，其特征在于，伤口愈合试验显示miR-203减少了DU145和PC3细胞的迁移。5.根据权利要求3所述，其特征在于，伤口愈合试验显示与只转染pSIN-miR-203p0.05相比，pSIN-miR-203和pSIN-SNAI2共同转染后细胞迁移能力增加。

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