申请/专利权人：湖北省农业科学院粮食作物研究所;中国农业科学院作物科学研究所

申请日：2019-03-07

公开（公告）日：2019-06-07

公开（公告）号：CN109852719A

主分类号：C12Q1/6895(2018.01)I

分类号：C12Q1/6895(2018.01)I;C12N15/11(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.03.04#授权;2019.07.02#实质审查的生效;2019.06.07#公开

摘要：本发明公开了一种用于检测抗赤霉病QTL Qfhb.hbaas‑5AL的分子标记及使用方法。本发明提供了检测小麦染色体5AL的SNP IWB42293位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性中的应用；还提供了检测小麦染色体5AL的SNP IWB42293位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性产品中的应用。本发明通过全基因组关联分析GWAS发现了位于小麦5A染色体短臂上抗赤霉病位点Qfhb.hbaas‑5AL，进一步将其关联SNP IWB42293转化为普通PCR标记M‑5AL‑Fhb，该标记可用于检测抗赤霉病QTL Qfhb.hbaas‑5AL的基因型，并用于抗赤霉病分子育种。

主权项：1.检测小麦染色体5AL的SNP IWB42293位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性中的应用；或检测小麦染色体5AL的SNP IWB42293位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性产品中的应用；所述SNP IWB42293位点为位于小麦染色体5AL上，物理位置为540.6Mb的位点。

全文数据：一种用于检测抗赤霉病QTLQfhb.hbaas-5AL的分子标记及使用方法技术领域本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测抗赤霉病QTLQfhb.hbaas-5AL的分子标记及使用方法。背景技术由禾谷镰刀菌等引起的小麦赤霉病Fusariumheadblight，FHB是一种广泛流行的真菌病害，严重影响小麦产量和品质。更重要的是，感病籽粒含真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇Deoxynivalenol，DON，危害人畜健康，影响食用和饲用。我国长江中下游和东北麦区是小麦赤霉病常发、重发区域。近年来，受全球气候变化、小麦–玉米轮作制度下秸秆还田的普及等影响，该病呈扩张、加重趋势，已成为黄淮麦区常发病害。当前我国小麦赤霉病年均发生面积超过533.3万hm2，2010～2015年造成年均总损失高达337万t，居小麦病害之首。培育利用抗病品种是降低赤霉病危害的经济有效手段。国内外对赤霉病抗性遗传进行了大量研究，已定位约100个抗赤霉病QTL，分布在小麦所有染色体，Fhb1～Fhb7等7个抗病基因被正式命名，其中来自苏麦3号位于3B染色体短臂的Fhb1抗性最强且稳定。然而，除Fhb1外，其它基因育种应用的报道较少。因此进一步挖掘抗赤霉病位点，开发其分子标记对于小麦抗赤霉病育种意义重大。发明内容为了挖掘抗赤霉病位点开发其分子标记，本发明的一个目的是检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质的用途。本发明提供了检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性中的应用；或本发明提供了检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性产品中的应用。或本发明还提供了检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在选育抗赤霉病小麦中的应用；或，本发明还提供了检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在制备选育抗赤霉病小麦产品中的应用。本发明还提供了检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在抗赤霉病小麦育种中的应用；或，本发明还提供了检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在制备抗赤霉病小麦育种产品中的应用。上述应用中，所述SNPIWB42293位点为位于小麦染色体5AL上，物理位置为540.6Mb的位点；或，所述SNPIWB42293位点的基因型为CC或TT。上述应用中，所述检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质包括引物对和限制性内切酶AgeI；所述引物对由引物F和引物R组成；所述引物F为如下a1或a2：a1序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物R为如下b1或b2：b1序列表中序列2所示的单链DNA分子；b2将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。上述应用中，所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。本发明另一个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，其为上述检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质；所述产品具有如下1或2或3至少一种功能：1鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性；2选育抗赤霉病小麦；3抗赤霉病小麦育种。本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性的方法。本发明提供的方法，为检测待测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型为CC还是TT，根据基因型判断所述待测小麦的赤霉病抗性；所述SNPIWB42293位点的基因型为CC的待测小麦的赤霉病抗性高于所述SNPIWB42293位点的基因型的基因型为TT的待测小麦。本发明第4个目的是提供一种选育抗赤霉病小麦的方法。本发明提供的方法，为检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型为CC还是TT，选育基因型为CC的待测小麦，得到抗赤霉病的小麦。上述方法中，检测待测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型为CC还是TT的方法为如下A或B：A90KSNP芯片分析；B用上述引物对所述待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，再用AgeI酶切扩增产物，检测酶切产物；若酶切产物仅为334bp大小，则SNPIWB42293位点的基因型为CC；若酶切产物为213bp和121bp片段，则SNPIWB42293位点的基因型为TT。上述酶切产物片段大小是通过电泳检测或者直接测序检测。以上任一所述小麦可为但不限于实施例部分表1中所示的240份小麦品种。本发明通过全基因组关联分析GWAS发现了位于小麦5A染色体长臂上抗赤霉病位点Qfhb.hbaas-5AL，解释表型变异5.4％，在2014和2015年，含抗病等位基因材料平均FHBindex比含感病等位基因材料低10.1％和21.3％。本发明专利进一步将其关联SNPIWB42293转化为CAPScleavedamplifiedpolymorphicsequences标记M-5AL-Fhb，两者对240份材料分型一致率为95.8％。该标记可用于检测抗赤霉病QTLQfhb.hbaas-5AL的基因型，并用于抗赤霉病分子育种。附图说明图1为Qfhb.hbaas-5AL不同基因型材料FHBindex比较。图2为M-5AL-Fhb对部分品种扩增结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。赤霉病病原菌黄冈1号：参考文献：朱展望,杨立军,佟汉文,等.湖北省小麦品种系的赤霉病抗性分析[J].麦类作物学报,2014,341:137–142.公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。实施例1、Qfhb.hbaas-5AL及其关联SNP标记的发现供试材料：国内外小麦品种系240份组建的WAPSWheatAssociationPanelforScabresearch群体，见表1。所用材料记载于文献：朱展望,徐登安,程顺和,等.中国小麦品种抗条锈病基因Fhb1的鉴定与溯源[J].作物学报,2018,444:473–482.公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。表1WAPS群体品种系及其来源a为90KSNP芯片分型结果；b为标记M-5AL-Fhb的检测结果；“-”为芯片数据缺失。一、Qfhb.hbaas-5AL及其关联SNP标记的发现1、赤霉病抗性鉴定于2014～2015连续2年在湖北省农业科学院南湖试验田进行赤霉病接种鉴定，病原菌菌株为黄冈1号。试验采用完全随机区组设计，2行区，行长1m，行距0.25m，2次重复。采用喷雾接种，接种后20d调查发病穗数、每穗小穗数和病小穗数，用公式：赤霉病病情指数FHBindex＝发病率×严重度，计算FHBindex，其中发病率为发病穗数与总穗数的比值，严重度为每穗病小穗数与小穗数比值的平均值，均以百分率计。2、基因型分析WAPS群体用90KSNP芯片进行基因型分析，选择其中22922个分型结果好的SNP用于后续分析，去掉缺失率超过20％、最小等位基因频率小于5％的标记，共剩余19803个SNP用于GWAS。3、GWAS分析采用Tasselv5.0软件kinshipK+PCA方法的混合线性模型进行关联分析。当P≤0.001时，认为该标记与性状显著关联。4、Qfhb.hbaas-5AL及其连锁SNP标记关联分析发现位于5AL上抗赤霉病位点，在2014和2015两个环境下显著，解释表型变异5.4％，代表性关联标记为IWB42293，其侧翼序列为：5’-attggaatggcaaacggtcgtggtggtggcagctacaacaatgccaccgg[TC]AGTGGTGATGGGGGCAACAGATATAACGGCGGTAGTGGCAGCGGCCACTG-3’序列3,在中国参考基因组序列IWGSC，http:www.wheatgenome.org上物理位置为540.6Mb表2。在2014和2015年，含抗病等位基因材料平均FHBindex比含感病等位基因材料低10.1％和21.3％图1。图1中**和*分别表示两种基因型材料间表型在0.01、0.05水平差异显著。表2Qfhb.hbaas-5AL及其连锁SNP标记SNP标记a变异位点b染色体物理位置cMb环境P值R2d％IWB42293TC5AL540.62014、20154.68E-045.4a代表性SNP标记，b下划线所示为抗病等位基因，c中国春参考基因组物理位置IWGSC，http:www.wheatgenome.org，e解释表型变异。SNP位点IWB42293位于5AL染色体物理位置为540.6Mb，其多态性为TC，该SNP位点的基因型为TT或CC,SNP位点IWB42293也是序列3第51位。二、M-5AL-Fhb标记专用引物的设计及其方法的建立1、基因组特异引物设计用SNPIWB42293的侧翼序列，在EnsemblPlants数据库http:plants.ensembl.org比对，获取其同源序列，设计其5A染色体特异引物P2293序列1和序列2，又名M-5AL-Fhb标记，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。P2293F：5’-CGATTCCGACCACCACGAG-3’序列1。P2293R：5’-GCCAGAGCACTGGTAATTACAGT-3’序列2；2、检测方法建立供试材料：国内外小麦品种系240份表1组建的WAPS群体。1PCR扩增提取待测小麦的基因组DNA，加ddH2O稀释其浓度至30ngμL作为模板，采用引物P2293F和引物P2293R组成的引物对进行PCR扩增。上述PCR扩增体系如表3所示；表3引物P2293的PCR体系PCR程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。经检测，PCR扩增产物片段大小为334bp。2、酶切用AgeI内切酶识别序列和酶切位点为5′-ACCGGT-3′37℃下过夜12h酶切上述PCR扩增产物，酶切反应体系10μL，含PCR扩增产物5μL，10×Buffer1μL，AgeI0.3μL，ddH2O4.7μL。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，若酶切产物仅为334bp大小，则SNPIWB42293位点的基因型为CC；若酶切产物为213bp和121bp片段，则SNPIWB42293位点的基因型为TT。结果如表1和图2所示。其中图2中，1-4为IWB42293基因型为CC的品种，5-8为IWB42293基因型为TT的品种。可以看出，基因型为CC材料酶切产物片段大小为334bp，基因型为TT材料酶切产物大小为213bp和121bp，表明该标记可以区分IWB42293基因型，并进一步区分抗赤霉病QTLQfhb.hbaas-5AL的等位基因，该标记标记命名为M-5AL-Fhb。该标记WAPS群体检测结果与SNPIWB42293分型结果一致率为95.8％，说明该标记转化成功。因此，SNPIWB42293标记可用于辅助检测待测小麦是否抗赤霉病，并用于抗赤霉病分子育种；具体方法如下：检测待测小麦基因组中SNP位点IWB42293的基因型，按照如下方法判断：SNP位点IWB42293基因型为CC待测小麦的赤霉病抗性高于或候选高于IWB42293基因型为TT待测小麦。上述检测待测小麦基因组中SNP位点IWB42293的基因型的方法如下：190KSNP芯片分析；2用P2293F和P2293R进行PCR，再用AgeI内切酶酶切PCR产物，检测酶切产物；若酶切产物仅为334bp大小，则SNPIWB42293位点的基因型为CC；若酶切产物为213bp和121bp片段，则SNPIWB42293位点的基因型为TT。3用P2293F和P2293R进行PCR，再用AgeI内切酶酶切PCR产物，直接对酶切产物进行测序。实施例2、实际样本检测供试材料：表1所示的WAPS群体品种。一、赤霉病抗性鉴定同实施例1。二、M-5AL-Fhb标记检测用M-5AL-Fhb标记按照实施例1中的方法，对表1所示的240个品种进行PCR扩增，再用AgeI内切酶酶切PCR产物，检测酶切产物；若酶切产物仅为334bp大小，则SNPIWB42293位点的基因型为CC；若酶切产物为213bp和121bp片段，则SNPIWB42293位点的基因型为TT。SNP位点IWB42293基因型为CC待测小麦的赤霉病抗性高于或候选高于IWB42293基因型为TT待测小麦。240份小麦品种标记检测结果和FHBindex平均值如表1所示。将表1的结果进行统计分析，得到表4的结果。表4为M-5AL-Fhb不同基因型品种赤霉病抗性差异从上述可以看出，SNP位点IWB42293为CC基因型待测小麦的FHBindex小于SNP位点IWB42293为TT基因型待测小麦，因此，SNP位点IWB42293为CC基因型待测小麦的赤霉病抗性高于或候选高于SNP位点IWB42293为TT基因型待测小麦。序列表湖北省农业科学院粮食作物研究所中国农业科学院作物科学研究所一种用于检测抗赤霉病QTLQfhb.hbaas-5AL的分子标记及使用方法2SIPOSequenceListing1.0119DNAArtificialsequence1cgattccgaccaccacgag19223DNAArtificialsequence2gccagagcactggtaattacagt23

权利要求：1.检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性中的应用；或检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性产品中的应用；所述SNPIWB42293位点为位于小麦染色体5AL上，物理位置为540.6Mb的位点。2.检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在抗赤霉病小麦育种中的应用；或，检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在制备抗赤霉病小麦育种产品中的应用；或，检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在选育抗赤霉病小麦中的应用；或，检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质在制备选育抗赤霉病小麦产品中的应用；所述SNPIWB42293位点为位于小麦染色体5AL上，物理位置为540.6Mb的位点。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述SNPIWB42293位点的基因型为CC或TT。4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质包括引物对和限制性内切酶AgeI；所述引物对由引物F和引物R组成；所述引物F为如下a1或a2：a1序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物R为如下b1或b2：b1序列表中序列2所示的单链DNA分子；b2将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。6.一种产品，其为权利要求1-5所述应用中的所述检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型的物质。7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述产品具有如下1或2或3至少一种功能：1鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性；2抗赤霉病小麦育种；3选育抗赤霉病小麦。8.一种鉴定或辅助鉴定小麦赤霉病抗性的方法，为检测待测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型为CC还是TT，根据基因型判断所述待测小麦的赤霉病抗性；所述SNPIWB42293位点的基因型为CC的待测小麦的赤霉病抗性高于所述SNPIWB42293位点的基因型的基因型为TT的待测小麦。9.一种选育抗赤霉病小麦的方法，为检测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型为CC还是TT，选育基因型为CC的待测小麦，得到抗赤霉病的小麦。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述检测待测小麦染色体5AL的SNPIWB42293位点的基因型为CC还是TT的方法为如下A或B：A90KSNP芯片分析；B用权利要求4中的所述引物对所述待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，再用AgeI酶切扩增产物，检测酶切产物；若酶切产物仅为334bp大小，则所述待测小麦SNP位点IWB42293的基因型为CC；若酶切产物为213bp和121bp片段，则所述待测小麦SNP位点IWB42293的基因型为TT。

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