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申请/专利权人：新加坡国立大学;新加坡保健服务集团有限公司

摘要：本发明提供了用于调节WARS2表达、WARS2活性或其组合，从而调节血管发生的方法和试剂。本文还提供了用于鉴定可受益于调节WARS2表达、WARS2活性或其组合之试剂的个体的方法。

主权项：在有此需要的个体中调节血管发生的方法，其包括施用有效量的调节WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

全文数据：调节WARS2的方法背景技术[0001]细胞的增殖是多种疾病的病理生理学的中心。例如，由内皮细胞的不受控制的增殖引起的血管发生在例如癌症、糖尿病性眼病、黄斑变性和关节炎中起重要作用。[0002]需要检测病理状况并治疗与细胞的不受控增殖相关的病症或疾病的方法，所述细胞的不受控增殖包括例如有助于血管发生的内皮细胞增殖。发明内容[0003]如本文所述，已经确定线粒体色氨酸tRNA合成酶WARS2在调节细胞增殖，特别是内皮细胞增殖中发挥作用，表明在与血管发生相关的多种病症中调节WARS2的益处。如本文所述，本发明提供了通过使用多种试剂控制WARS2表达、WARS2活性或其组合来调节血管发生的方法，所述试剂包括但不限于核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其任意组合。[0004]在另一个方面，本发明提供了调节内皮细胞以外的细胞（例如癌细胞）增殖的方法。因此，本文描述了通过使用多种试剂控制WARS2表达、WARS2活性或其组合来调节例如癌细胞增殖的方法。[0005]本文还提供了鉴定将受益于调节WARS2表达、WARS2活性或其组合之患有例如肿瘤或心血管病症的个体的方法。[0006]附图简述[0007]图1A-1C示出在三个（3独立时间点的大鼠基因组冠脉血流的遗传作图鉴定控制冠脉血流的大鼠染色体2q34上的单个基因座。1A:F2杂交中的遗传作图。Y轴，显著相关的置信度（1=100%，红线=显著性阈值）；X轴，在大鼠基因组中的位置。1B:使用作图品系和其他品系（BN=棕色挪威（BrownNorway，SHR=自发性高血压大鼠（spontaneouslyhypertensiverat，LEW=Lewis大鼠（Lewisrat,WKY=ffistarKyoto大鼠（WistarKyotorat的该区域的单倍型精细化haplotyperefinement。1C:基因座处基因表达的遗传控制。发现两个基因在强遗传控制下，Pexllb和Wars2。[0008]图2A-2E示出了多种大鼠品系的冠脉血流。（2ALew、SHR和WKY品系中的低血流，2B在SHR.BN2同类系congenic中的低血流的拯救。（2C在SHR.BN2同类系中的不同毛细血管密度。（2D在冠脉血流coronaryflow，CF基因座处带有SHR等位基因之基因型的基因型特异性效应，具有较低流量。（2E与BN大鼠中的野生型等位基因（SEQIDN0:8高血流）相比，在SHRSEQIDN0:5、LewSEQIDNO:6和WKYSEQIDNO:7低血流）中，亮氨酸残基53突变为苯丙氨酸F。示出了从小鼠（SEQIDN0:9、人（SEQIDNO:10、鸡（SEQIDNO:11、果蝇（SEQIDNO:12、斑马鱼（SEQIDNO:13并回到酵母SEQIDNO:14的该残基的保守性。[0009]图3示出了野生型wild-type，WT和L53FWARS2在线粒体中的定位以及突变酶受损的酶促活性。WARS2细胞定位的共聚焦图像分析。用WT或L53FWARS2-GFP转染人胚肾细胞humanembryonickidneycell，HEK293细胞），并且在24小时后，将细胞固定，透化并用抗cox4标记（中间两个图）。在最右边两个图中示出了WARS2与cox4的共定位。条尺寸=5μηι。[0010]图4示出WARS2结合WARS，该效应由人WARS2蛋白中的WARS2L53F突变减弱；即WARS2L53F与WARS的结合较不强烈。用无载体模拟）、flag标记的野生型WARS2WT或flag标记的WARS2L53F突变体MUT转染人脐静脉内皮HUVEC细胞并分析免疫沉淀的flag蛋白质与WARS的相互作用。[0011]图5示出WARS2调节HUVEC细胞培养基中的WARS分泌。使用siRNA的WARS2基因沉默上）导致响应于IFNy刺激的增加的WARS分泌。相反，使用腺病毒载体的WARS2过表达（下）抑制WARS分泌。[0012]图6A和6B:图6A示出WARS2沉默（siWARS2对剪接的WARS转录本表达没有影响。图6B示出在基线时和IFN-γ刺激后内皮细胞中的WARS亚细胞定位。[0013]图7举例说明WARS2结合GAIT复合体的组分，该效应在L53F突变体中未见到。用Flag标记的WARS2或Flag标记的WARS2L53F转染HUVEC细胞并且将flag纯化的部分进行印迹检测与GAIT复合体蛋白质的相互作用。[0014]图8示出WARS2过表达导致关键GAIT组分RPL13a的蛋白体降解，其可通过添加抑制剂MG132逆转。突变体WARS2L53F对L13a表达没有影响。[0015]图9表明WARS在外泌体中从HUVEC分泌到培养基中，该效应不受布雷菲德菌素AbrefeldinA，BFA抑制。AnnexA2=膜联蛋白A〇[0016]图10示出使用针对Wars2起始密码子ATGM0的吗啉代沉默斑马鱼Wars2基因的剂量依赖性作用。该作用被人WARS2蛋白的过表达逆转。[0017]图11示出使用针对Wars2起始密码子的吗啉代沉默斑马鱼Wars2基因对血流（左上）、存活右上和心脏功能（左下）的剂量依赖性作用。C0=心输出量cardiacoutput;dpf=受精后的天数dayspostfertilization。条，平均值;误差条，SEM。[0018]图12示出用Wars2抑制的Flk-GFP鱼中的异常血管形成，以及剂量依赖性作用的量化左下）。[0019]图13是大鼠WARS2SEQIDN0:1、小鼠WARS2SEQIDN0:2和人WARS2SEQIDN0:3的氨基酸序列比对。突出显示的序列"PTGIPHLGNYLGA"示出在突变体WARS2L53F中突变的赖氨酸残基L的位置。[0020]图14示出人WARS2SEQIDN0:4的cDNA序列。突出显示的序列是siRNA所靶向的区域。[0021]图15是示出在存在三种不同WARS2siRNA的情况下，HEK293细胞中WARS2mRNA表达的敲低的柱状图。[0022]图16是示出控制WARS2表达的WARS2SNP也控制人血浆中WARS水平的图。**，PXX中的标志物，并且在模型中使用SNP基因型作为回归量。默认参数用于层次演化随机搜索HierarchicalEvolutionaryStochasticSearch，HESS。需要0.8的边际后验概率来通过SNP鉴定表型的遗传调节。通过取得由HESS选择的标志物周围的两个标志物之间的范围，获得相应的单倍型。[0120]eQTL作图[0121]使用ESS++程序对eQTL作图。模型中包括通过F2中的微阵列测量的三个mRNA表达水平作为因变量，并且基因型用作回归量。[0122]结果[0123]本研究将WARS2鉴定为冠脉血流和毛细血管密度的新基因。冠脉血流的遗传控制是未知的。本文描述的是使用与描述于McDermott-Roe等，Nature，478:114-1182011;Petretto，等，NatGenet，40:546-5522008的方法相似的方法在大鼠中的大规模F2互交实验中对其的研究。[0124]使用Langendorff制剂在棕色挪威-自发性高血压大鼠（BN-SHRF2群中的172只大鼠的三个时间点测量冠脉血流。研究了广泛接受的在大鼠群中冠脉血流的决定因素的作用。虽然发现左心室松弛压（dpdtmin对冠脉血流的强烈作用（r=-0.34，p=4.6X10，，但未观察到收缩或舒张血压的作用分别P=〇.19和p=0.36，这表明调节大鼠群冠脉血流的血压非依赖性机制。[0125]使用HESSBottolo等，Genetics,189:1449-14592011在三个不同时间点对最大和平均冠脉血流作图。通过利用这些表型之间的相关性结构，HESS联合模拟多个表型。[0126]观察到在基础水平、缺血后和梗死时测量的冠脉血流与位于大鼠染色体2q34上的单个基因座的强烈且一致的关联如图1所示）。单倍型限制的上限源自两个相邻标志物的位置，表明致病性遗传变体可位于189.3和194.5Mb之间。[0127]来自BN和SHR左心室组织中的RNA-seq分析在该区域中鉴定了42个表达的基因，其中三个具有显著的eQTL图1。发现两个基因Wars2和组织蛋白酶-SCathepsin-S具有非同义变异。组织蛋白酶S在部分保守的蛋白质位点处具有变异，并且在心脏中低表达。另一方面，Wars2是在心脏中高度表达的线粒体氨酰基tRNA合成酶aARS，并且是核编码的和线粒体定位的;其将色氨酸转移至其同源tRNA。[0128]许多aARS酪氨酸ARSYARS，丝氨酸ARSSARS，细胞质色氨酸ARSWARS在演化过程期间在血管发生中获得了非典型的功能，并且WARS的切割产物已经示出抑制VEGF信号传导。因此，将Wars2优先作为大鼠2q34基因座处控制冠脉血流的候选基因。[0129]小毛细血管的阻力极大地控制心脏中的血流量。检查了在互交中和对基因型条件化condition的F2互交动物中基因座的毛细血管密度，并且发现基因座的显著效应P=1·3χ10-13见图2。[0130]实施例2[0131]WARS2的表征及其与WARS的相互作用[0132]材料与方法[0133]抗L13a和膜联蛋白A来自CellSignalingjlexa-488568山羊抗小鼠兔IgG来自MolecularProbes。抗VEGF和GAFOH来自SantaCruz，所有其他抗体来自Abeam。在用KMSKSDPDKLATVCSEQIDN0:15或CILTSMKKVKSLRDPSSEQIDN0:16肽免疫接种兔后获得多克隆抗WARS2兔抗血清。使用EurogentecEngland的相应肽产生并色谱纯化它们。使用QuikchangeII定点诱变试剂盒（Stratagene根据制造商的说明使用含有具有C-末端myc-DDK或GFP的人WARS2cDNA的质粒构建体（Origene作为模板产生L53F突变体WARS2cDNA。通过核苷酸测序验证L53F。腺病毒（Ad-GFP，Ad-WARS2购自SignaGenLaboratories。从由人HUVEC细胞提取的RNA合成人WARScDNA，并且使用引物PCR扩增编码区，所述引物在正向引物中含有EcoRI和Kosac序列，且在反向引物中含有flag序列和Xbal。验证序列后，将WARS克隆到pLVX-EFla-IRES-PuroClontec中。[0134]细胞培养、转染和腺病毒转导[0135]将人胚胎肾humanembryonickidney，HEK293细胞维持在补充有10%胎牛血清和100Uml青霉素和100μgml链霉素的DMEM中。人脐静脉内皮HUVEC细胞和培养基EBM单季铵盐（singleQuats和EBM-2单季铵盐购自Lonza并在第7代之前使用。对于质粒转染用于HEK293，在70%汇合前一天接种细胞，并根据公司的说明使用1ipofectamine200InvitroGene转染试剂。对于HUVEC转染，根据公司的说明使用PolyplusjetPEI-HUVEC转染试剂POLYPLUS-TRANSFECTIONInc.NewYork。对于基因转移，在6孔板或T75烧瓶中将HUVEC培养至80%汇合。在HUVEC生长培养基中在lml6孔板或10mlT75烧瓶）的总体积中以200个斑形成单位（plaque-formingunit，pfu的感染复数（multiplicityofinfecti〇n，M0I进行细胞的转导。感染后24小时，将细胞在含有1%FBS的培养基中孵育1小时，然后补充500Uml人重组IFNR&DSystems另外孵育24小时，之后处理以用于分析。[0136]用于酶测定的GST融合蛋白[0137]将WARS2和WARS2L53FcDNA克隆到市售载体见表）中，使用IPTG诱导进行表达并使用标准测序基于GSH珠进行纯化。使用标准孔雀石绿测定Caymanchemicals对纯化的蛋白质进行定量。[0138]从培养的细胞提取RNA[0139]使用RNeasyMini试剂盒Qiagen根据制造商的说明提取总RNA。简言之，将细胞裂解于350μ1RLT缓冲液中并应用于Shedder柱Qiagen，并以14,000rpm旋转1分钟。将裂解物与等体积的70%乙醇混合并且应用于RNeasy柱，然后将其离心并使用提供的RW1和RPE缓冲液洗涤。最后，在体积为30μ1的无RNA酶的水中洗脱总RNA，并使用Nanodrop1000ThermoFisherScientific通过在260nm处测量吸光度来定量。将RNA储存在-80°C直至需要。[0140]定量实时PCRQPCR分析和WARS剪接PCR[0141]使用iScript第一链cDNA合成方案Bio-Rad逆转录总RNAlyg。使用SYBRGreenJumpStartTaqReadyMixS4438，Sigma，在20μ1反应中对所得cDNAlyl进行QPCR，并在7900HT快速实时PCR系统AppliedBiosystems上运行。在每组至少三个独立实验中使用每个siRNA处理的三个独立6孔培养物，且每个样品一式两份地运行。使用2-△ACT法分析所有数据。[0142]表1.引物序列[0143][0144]为了检测WARS剪接变体，在50μ1PCR反应中使用ΙμLWARS的cDNA和28S的120稀释的cDNA，并使用24次循环根据QPCR中的解链曲线确定）。[0145]蛋白质提取和Western印迹[0146]在含有蛋白酶抑制剂Sigma和磷酸酶抑制剂Halt磷酸酶抑制剂混合物，ThermoScientific和PMSF0.5mM，ActiveMotif的细胞裂解缓冲液（9803，CellSignaling中裂解细胞。然后将细胞裂解物短暂超声，并在14,000g4°C下离心10分钟。保留上清液，并使用用牛血清白蛋白标准物的二辛可酸测定来测定蛋白质浓度。在1〇%或13%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质样品（2〇yg，转移至硝酸纤维素膜，并如图例所述用抗体探测。使用过氧化物和LumiGlo试剂CellSignaling，用辣根过氧化物酶缀合的二抗显现免疫反应条带。[0147]siRNA介导的WARS2敲低[0148]将HUVEC细胞接种在6孔板中。24小时后，根据制造商的说明，使用DharmaFECT-1ThermoScientific用WARS2靶向的ON-TARGETplusSMARTpool转染细胞。对于给定的转染，将24μ1DharmaFECTl和476μ1opti-MEMInvitrogen在一个管中混合，同时将5μ1的上述WARS2靶向或乱序的（scrambled对照siRNA20μΜ与490μ1opti-MEM在第二个管中混合。在室温下孵育5分钟后，将上述溶液混合，并在室温下再放置20分钟，然后添加至细胞。最终的siRNA浓度为25nM。转染后2天通过QPCR评估敲低效力，发现为至少85%。虽然我们制备的两种抗WARS2抗体可以检测来自表达WARS2-flag的细胞之裂解物中的WARS2，但是由于没有针对WARS2的抗体可以检测内源WARS2，所以通过western印迹不能确定敲低效力。[0149]免疫荧光[0150]将细胞以约80%汇合度接种到灭菌的盖玻片上。对于免疫荧光分析，将细胞在室温下在3%wv多聚甲醛中固定15分钟，并在含有0.3%TritonX100的磷酸盐缓冲盐水PBS中透化4分钟，并在含有l%wv牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA的PBS中封闭。将细胞与一抗孵育1小时（稀释140-100，然后用Alexa488568缀合的山羊抗小鼠兔IgG高度交叉吸收;稀释1100孵育1小时，两者均在环境温度下进行。将盖玻片用含有DAPI的Vectashield抗褪色封片介质VectorLaboratoriesInc.封片在载玻片上。使用60x油物镜在Leica共焦显微镜上观察细胞，并使用Leica共聚焦软件（LeicaMicrosystemsUKLtcUMiltonKeynes，UK分析图像。[0151]L53F和野生型WARS2和WARS慢病毒的制备[0152]使用EcoRIXbal位点，将用flag或GFP标记的WARS2WT和L53F或WARS-flag的cDNA亚克隆到pLVX-EFla-IRES-zsGreen目录号631982，Clontec或pLVX-EFla-IRES-mCherry目录号631987Clontec或pLVX-EFla-IRES-Puro载体（目录号632183，Clontec中。根据制造商的方案Clontec，使用Lenti-XHTX包装系统（631247在Lenti-X293T细胞中产生特定病毒。[0153]用于产生WarscDNA的引物[0156]用于产生Wars2_FLAG的引物[0157]正向：[0158]反向：[0159]用于产生Wars2_GFP的引物[0160]正向：[0161]反向：[0162]线粒体分级和外泌体分泌[0163]为了分离胞质和线粒体，根据使用说明书使用线粒体分级试剂盒（ActiveMotif。使用针对线粒体蛋白复合体I的抗体Mitoscience或可溶性胞质蛋白质微管蛋白Sigma的抗体来验证线粒体和胞质级分的纯度。使用试剂盒（Invitrogen，4478359根据制造商的说明从HUVEC裂解物产生外泌体集合物。[0164]免疫沉淀和质谱法[0165]对于免疫沉淀，在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂Halt磷酸酶抑制剂混合物，ThermoScientific和PMSF0.5mM的裂解缓冲液（cellsingaling中制备细胞裂解物。根据公司的方案，将抗FLAGM2亲和凝胶Sigma用于纯化Wars2flag标记的蛋白质。在洗脱之前，用在PBS中的0.5%NP40洗涤蛋白质珠，然后在50mM碳酸氢铵中洗涤三次，并且在50mM碳酸氢铵中的200ygmLFLAG肽3xflag肽，Sigma中洗脱结合的蛋白质。使用全溶液消化法的全定性加定量分析进行质谱法。[0166]结果[0167]在HEK细胞中WARS2和WARS2L53F定位于线粒体[0168]WARS2是核编码的、线粒体定位的aARS。检查了人WARS2和突变的人WARS2L53F的定位，其具有与大鼠中相同的氨基酸变化。突变体和野生型均定位于线粒体本文在图3中示出）。[0169]WARS2与WARS结合，但突变体WARS2L53F不结合[0170]aARS可以与它们自身和彼此形成影响其功能的更高度阶寡聚化。测试了WARS2是否结合其具有已知抗血管发生功能的胞质对应物WARS。发现在HUVEC细胞中WARS2与WARS结合。该作用被L53F突变减少如图4所示）。[0171]WARS2表达影响WARS分泌，其为一种在蛋白质水平介导的作用[0172]WARS片段通过结合VE-钙黏着蛋白具有抗血管发生活性。不清楚WARS分泌的调节。WARS2过表达抑制WARS分泌，而WARS2基因沉默增加的WARS分泌。这种作用在蛋白质水平介导，并且没有发现与剪接或转录作用相关。[0173]培养HUVEC细胞，并用编码WARS2的腺病毒感染或用针对WARS2的siRNA转染。在所有实验中使用对照病毒和siRNA。与对照相比，WARS2功能获得降低了WARS分泌。与对照相比，WARS2功能丧失增加了WARS分泌见图5。总之，这些数据示出WARS2调节将对血管发生具有下游作用的WARS分泌。虽然已知WARS转录由IFN-γ刺激增加并且存在WARS的可变剪接，但是在本文中没有示出WARS2对这些事件的作用见图6A。因此，WARS2对WARS的作用处于蛋白质水平。[0174]WARS和WARS2相互作用的细胞定位[0175]WARS主要是胞质蛋白质，但WARS的组分是线粒体定位的，并且在HUVEC中干扰素IFN-γ刺激后该亚库增加。[0176]本文证明了WARS和WARS2之间的相互作用。在亚细胞分级实验中，在线粒体中检测到WARS，并且该亚库在IFN-γ刺激下增加。因此，预期该蛋白质-蛋白质相互作用发生在线粒体级分中，并且该线粒体级分可能在WARS从细胞分泌中起作用参照图6B。[0177]WARS2与GAIT复合体的组分相互作用[0178]为了进一步了解WARS2的蛋白质-蛋白质相互作用，进行了质谱法（massspectrometry，MS。在本文的实验中，MS数据表明WARS2与EPRS-种aARS、GAPDH和RPL14a相互作用。这些蛋白质与NSAP1-起定义了GAIT复合体，其通过结合靶基因的3'UTR对于控制VEGF和炎性基因的蛋白质表达是重要的。[0179]MS数据单独是不确定的，因为在这种类型的实验中鉴定了许多相互作用，并且需要下游证实。为了证实该相互作用，用WARS2和WARS2L53F突变体进行co-IP实验。记录到了WARS2而非L53F突变体与EPRS、GAPDH和RPL14a的相互作用（如图7所示）。[0180]此外，如本文所示，WARS2的过表达通过将RPL14a靶向蛋白酶体而引起RPL14a的显著损失，这种作用可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转参照图8。[0181]这些数据示出，WARS2在控制VEGF活性方面在第二水平上起作用，这里通过调节GAIT复合体的活性起作用，该复合体除了控制许多细胞因子和趋化因子（例如，CXCL13、CCL22、CCL8和CCR3的翻译外，还控制VEGF的翻译。[0182]WARS经由外泌体微囊泡途径进行非典型分泌[0183]先前的研究已经示出WARS被分泌，但是分泌途径却是非典型的，且没有被表征。在HUVEC细胞中检查布雷菲德菌素A抑制高尔基体介导的分泌的试剂对WARS分泌的作用。如前所述，没有观察到作用。进一步的研究示出WARS分泌在外泌体中，该作用被WARS2抑制（图9。这定义了在外泌体中WARS的新分泌途径。[0184]实施例3[0185]在斑马鱼中WARS2的功能丧失导致受损的血管发生和受损的心脏功能[0186]方法[0187]使用标准方法进行在斑马鱼中的吗啉代实验和斑马鱼血管形成的成像。[0188]结果[0189]为了检查Wars2对血管发生和心脏的体内作用，使用针对Wars2第一密码子的吗啉代抑制斑马鱼中Wars2的活性。对鱼形态和存活有显著作用，这是由于血管形成和心脏功能的缺陷，总结在图10-12中。[0190]实施例4[0191]人胚肾HEK293细胞中的siWARS2敲低[0192]方法[0193]在转染前一天将HEK细胞接种在10cm培养皿上。在约50%的密度下，使用RNAimax制造商的方案）进行转染。通过使用120nMsiRNA和20μ1lipofectaminRNAimax在lml0ΡΊΊΜΕΜ中的混合物制备siRNA。将细胞孵育，用roS洗涤IX，然后用5ml0ΡΊΊΜΕΜ覆盖，并滴加lipofectaminsiRNA混合物。将细胞孵育（6小时），然后将培养基更换为（DMEM10%FBS。按照方案（Qiagen提取RNA。使用Nanodrop评估RNA定量，并基于0D比260nm280um确定质量。使用lygRNABioradiScriptTMcDNA合成方案进行逆转录并使用QuantiFASTSYBRgreen方案进行QPCR。[0194]用于人WARS2的引物[0197]用于人GAPDH的引物[0200]循环条件：[0201]95C5分钟[0202]95C10秒][0203]60C30秒]40x[0204]95C15秒[0205]60C1分钟[0206]-式两份地分析所有样品，并测定平均值和标准偏差。通过范围为60-95Γ的解链曲线确定扩增的特异性。使用标准ddCt法进行以GAPDH的归一化。[0207]实验重复5次，以下结果如表2和图15所示。[0208]表2.在HEK293中siWAR2敲低的结果[0210]WARS2siRNAl：[0211]正义：5'-GCAUUCAACCUACAGGAAU-3'SEQIDNO:50[0219]这三个siRNA序列对分别靶向下述WARS2序列的区域。在一些方面，siRNA序列在siRNA对的正义链和反义链二者的3'末端均包含额外的胸腺嘧啶T，以提高siRNA对细胞内核酸酶活性的抗性。在一个特定方面，siRNA正义链和反义链在3'末端包含两个TTT。[0220]siRNAl靶标[0221]siRNA2靶标[0222]siRNA3靶标[0223]图14显示了WARS2的cDNA，其指示了三种siRNA靶向的位置，如上所述。[0224]实施例5[0225]与更高WARS2表达相关的WARS2SNP控制人血浆中的WARS水平[0226]WARSELISA[0227]使用ELISA测定人血浆中的WARS并与WARS2的SNP基因型（rs984222进行比较。根据制造商的说明（ABIN366223;Antibodies-onlineGmbH，Aachen，Germany使用ELISA测定血浆中的WARS水平。从健康志愿者收集血浆，等分并储存在-70°C。每次测量使用100μΙ未稀释的血衆。一式两份进行标准曲线，并确定检测极限为〇.〇78ngml。在微板读数器uQuant;BiotekInstruments，UK上读取450nm在540nm校正）下的0D。[0228]WARS2SNP测定[0229]在WARS2SNP测定中使用了SNPID:rs984222。[0230]测定：LifeTechnologies测定ID:C_8699051_10[0231]使用的系统：LifeTechnologiesSteponeplusrtPCR[0232]表3.PCR条件：[0234]荧光序列：[0236]VIC染料C核苷酸，FAM染料G核苷酸[0237]本研究探究了WARS2SNPRS984222,其具有CG颠换替换的多态性。为了研究健康志愿者组中这种多态性的比率，使用了LifeTechnologies的预制测定（测定ID:C__8699051_10。该测定使用VICFAM染料混合物来测定存在的SNP。该测定使用LifeTechnologiesSteponePlus在实时PCR上进行，并用SteponePlus软件ν2·1进行分析，其产生等位基因鉴别图以确定SNP。[0238]结果[0239]数据示出，控制WARS2表达的WARS2SNP也控制人血浆中的WARS水平。如本文所示，提高的WARS2表达降低了WARS分泌。使用夹心ELISA方法参见上述方法部分），确定与多种组织包括脂肪）中更高水平的WARS2表达相关的WARS2SNPrs984222是否与人血浆中WARS的循环水平降低有关。这揭示了SNP对人血浆中WARS的作用。与G:C等位基因（组织中的中等WARS2表达相比，以及与C:C等位基因（组织中的低WARS2表达相比，G:G等位基因纯合的个体组织中的高WARS2具有在人血浆中更低水平的WARS。见图16。[0240]实施例6[0241]WARS2表达调节外泌体中的WARS分泌[0242]方法[0243]细胞培养和免疫细胞化学[0244]使用EBM-2培养基Lonza培养人脐静脉内皮细胞HUVEC;Lonza。两次传代后，将细胞用TrypLETMLifeTech消化，并以5,000个细胞cm2的密度接种到8孔室载玻片ibidi中。在50%汇合度时，以100的感染复数添加表达人1六1^2或6??的腺病毒PRECISIONTECHNOLOGIES48小时）。使用低血清EBM-2培养基，并用干扰素-γ500单位ml，48小时刺激所选择的细胞。将细胞用4%甲醛固定15分钟，并用PBS洗涤三次。将细胞用0.1%Triton-100处理（10分钟并用roS洗涤三次。使用含1%BSA的roS封闭（30分钟）。使用一抗WARS，Abeam，1:200于1%BSA中），并将细胞在4°C下孵育过夜。然后在PBS中洗涤细胞x3，并与二抗AlexFluor缀合，LifeTech，1:1000孵育30分钟）。用PBS洗涤3x后，将细胞与鬼笔环肽AlexFluor缀合，LifeTech，1比200孵育30分钟。然后用roS洗涤细胞x3，用DAPI孵育（LifeTech，1比1000,5分钟），并用PmLong⑧GoldAntifadeLifeTech封片。使用激光扫描显微镜LSM710，Zeiss使用相同设置获取图像。[0245]结果[0246]共焦图像示出WARS在外泌体中分泌。此外，WARS2的表达通过在细胞中捕获WARS而抑制这些外泌体的分泌（参照图17。用对照病毒（示于图17中，左图）或表达WARS2的病毒示于图17中，右图）感染HUVEC细胞，用干扰素γ刺激，然后对WARS、肌动蛋白和细胞核染色。在对照细胞中，看到含有WARS的膜结合外泌体微囊泡从细胞的质膜出芽箭头）。相比之下，在WARS2感染的细胞中，大量的WARS积累在质膜上（*，而不是在外泌体中。[0247]实施例7[0248]锌指核酸酶破坏WARS2导致血管密度降低[0249]方法[0250]大鼠中Wars2的破坏[0251]用针对ZFN革E位点的锌指核酸酶zincfingernuclease，ZFN革E向第一外显子的末端区域中的BN大鼠Wars2基因座：[0252]ACCCACAGCTACTGCggctcCCCAGGTAACCCGAGSEQIDN0：39Sagelaboratories,PA，USA。通过测序筛选基因破坏并在ZFN靶位点的外显子1中鉴定到8bp的缺失。这导致在Wars2蛋白的氨基酸27之后的框移位和在Wars2的氨基酸53之后的外显子2中的提前停止。[0253]突变品系的基因分型[0254]使用E.Z.N.A组织DNA试剂盒OMEGAbio-tek根据制造商的方案从趾夹样品（toeclipsample提取基因组DNA。纯化后，对由JumpStartTaqReadyMixSigma和ΙμΜ的以下引物组成的每个样品进行PCR:[0257]?0?循环条件：（〇951€5分钟；出）951€30秒；出〇651€30秒；（"）721€30秒；^循环2至4重复30次；（vi72°C5分钟；（vii4°C保持。将PCR产物在5%琼脂糖凝胶上跑胶。预期的条带大小是⑴野生型=92bpii杂合缺失=92bp和84bpii纯合缺失=84bp。[0258]结果[0259]这些大鼠体内结果示出Wars2水平影响毛细血管密度和冠脉血流。具体来说，当Wars2水平低时，毛细血管密度低。此外，当Wars2低时，心脏中的毛细血管面积也低。类似地，当Wars2水平低时，心脏中依赖于毛细血管密度的冠脉血流低。图19A-C说明了这些结果。图18示出使用锌指核酸酶有效破坏了Wars2。[0260]实施例8[0261]WARS2活性抑制[0262]方法[0263]WARS和WARS2AMP-glo酶测定[0264]使用基于用AMP-GloTM试剂Promega优化的化学发光的ATP耗尽测定，并使用96孔形式测定进行WARS和WARS2酶测定。反应缓冲液含有25mMTris-HCLpH7.2、10mMMgCl2、50mMKC1、2.5mM二硫苏糖醇、0.lmgmL牛血清白蛋白、0.2mM精胺、lOUmL焦磷酸酶并且所用酶的浓度为200nM。底物浓度如下：L-色氨酸100μΜ、批量bulk大肠杆菌E.colitRNASigma200ygmL和ATP100μΜ。反应在37°C下进行1小时，随后添加试剂IAMP-glo试剂盒）。将板在室温下再孵育1小时。在该小时结束时，将AMP检测溶液添加至所有样品，并在室温下孵育1小时。通过用InfiniteM200微板读数器Tecan测量发光来收集数据。根据指示添加10微摩浓度的吲哚霉素。[0265]结果[0266]合适的化合物可用于抑制WARS2活性。例如，本研究示出吲哚霉素抑制人线粒体WARS2,但不抑制人胞质WARS活性。WARS2活性的这种抑制可以与其他抑制模式组合。例如，WARS2突变体大鼠突变L53F与较低的血管生长和较低的WARS2酶活性相关。因此，使用例如基因治疗方法，可以将WARS2突变体形式L53F引入对象中以降低酶活性从而抑制血管生长。这样的靶向基因治疗方法还可以与其它WARS2抑制剂例如吲哚霉素或相关化合物组合以抑制血管生长。图20A和20B说明了这些结果。[0267]实施例9[0268]使用胆固醇修饰的siRNA在大鼠眼中体内敲低WARS2[0269]方法[0270]非革巴向（non_targeting，NTsiRNA和siWars2两者均购自Dharmacon，并在所提供的无菌siRNA缓冲液中配制。将五十50yg的siWars2玻璃体内注射到三只F344大鼠中各自的一只眼中，总体积为5μ1。将相同剂量的NT对照siRNA注射到每只动物的对侧眼睛中。48小时后收集视网膜和脉络膜，并通过TrizolAmbion提取总RNA。然后根据生产商的方案BioRad合成cDNA。[0271]通过使用以下引物，用SYBRgreenmastermixQiagen进行实时PCR反应以测量Wars2的表达，并以GAPDHmRNA水平归一化：[0272]Wars2正向：[0273]Wars2反向：[0274]GAPDH正向：[0275]GATOH反向：[0276]结果[0277]使用胆固醇修饰的siRNA在大鼠眼中体内有效地敲低Wars2。与非靶向siRNA相比，Wars2靶向siRNA示出对Wars2表达的更强抑制。见图21。[0278]NT-siRNA[0284]实施例1〇[0285]血管发生的体外模型[0286]方法[0287]管形成测定[0288]siRNA转染48小时后或者腺病毒转导或siRNA基因敲低48小时后，收获HUVEC并以每孔8,000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔用50μ1基质胶CorningMatrigel基质，生长因子降低）预包被。在完全EGM-2培养基中培养8小时后，以5X物镜DM3000倒置显微镜，Leica获取每个孔（中心位置的图像。通过WimTubeWimasisImageAnalysis分析图像。[0289]结果[0290]WARS2的调节导致血管形成（即血管发生）的增加和或减少。WARS2功能的丧失导致血管发生非常显着的减少，如通过内皮细胞的管形成；总管长度；和分支点的数目所测量。数据可见于图22A-C中。相比之下，WARS2功能的获得示于图22D-F中）导致这些血管发生量度的相应增加。[0291]实施例11[0292]siWARS2引起内皮细胞增殖的减少[0293]方法[0294]将在8孔室载玻片中培养的!1爪^：用4%甲醛固定。将细胞用0.1%1^切111-100透化并与AlexaFluor488鬼笔环肽孵育MolecularProbes，l比200于PBS中，30分钟）。将细胞核用DAPI染色MolecularProbes，1比1000于PBS中，5分钟）并将细胞用ProLong金抗褪色封片剂MolecularProbes或VECTASHIELD封固介质（VectorLaboratories封片。使用共聚焦激光扫描显微镜LSM710,Zeiss和超分辨率结构照明显微镜ELYRAPS.1，Zeiss获取图像。将超分辨率图像根据制造商的说明通过具有SIM模块的ZEN软件Zeiss进行后期处理。[0295]细胞计数：通过胰蛋白酶消化收获粘附的HUVEC，并使用自动化细胞计数器CountessAutomatedCellCounter;Invitrogen计数。[0296]结果[0297]可在图23A的高分辨率显微照片中看到对细胞形态的作用。在抑制的WARS2存在下，肌动蛋白纤维全部消失，且线粒体形成团块。这降低了内皮细胞迀移和分裂的能力;存在核不完全分离，且细胞积累在G2M期（参照图24A和B。这些变化的下游作用是由于细胞死亡而减少的增殖。显著抑制的增殖能力可以在图23B所示的图中看出。[0298]实施例12[0299]Wars2的抑制在体力乳腺癌血管发生模型中阻止血管生长[0300]方法[0301]基质胶栓的血管发生测定[0302]在冰上或在4°C冰箱中解冻Corning基质胶膜基质（无LDEV:5mlFisher，目录号CB-40234A。在将基质胶保持在冰上的同时，在基质胶中添加重组大鼠VEGF164R&DSystems，目录号564-RV-010CF的重构储液0·5mgml，在无菌PBS中）至500ngml的终浓度。将500μ1的冷VEGF基质胶装到冷却的lml注射器中，并盖有23或27号针头（其上有帽）。将注射器保持在冰上以保持冷却直到注射。[0303]使用异氟烷或氯胺酮混合物麻醉大鼠。捏住最低和次低乳头之间的乳房脂肪垫mammaryfatpad，MFP，略微提起，并将500μ1的基质胶注射入MFP中。基质胶立即固化。在注射后5天，将大鼠安乐死并从脂肪组织小心地切除基质胶栓。将组织包裹在箱中并立即在液氮中冷冻。[0304]结果[0305]在受抑制的Wars2存在下，在乳腺癌血管发生模型中体内血管生长受阻。研究了具有正常Wars2的三只大鼠和携带Wars2L53F突变的三只大鼠（使用锌指核酸酶突变，如本文所述，还参见图18。在具有和表达正常Wars2的大鼠中，在所检查的三只大鼠的每一只均中观察到血管生长至VEGF基质胶栓中。相比之下，在已通过使用锌指核酸酶的突变抑制Wars2的三只大鼠中，几乎没有看到血管生长到VEGF基质胶栓中。具有和不具有再生长的基质胶栓可以在图25中看到。因此，WARS2抑制有益于特征为增强的和或不期望的血管生长的疾病例如癌症和各种眼病）。[0306]实施例13[0307]在激光诱导的脉络膜新血管形成（choroidalneovascularization，CNV的大鼠模型中评估Wars2siRNA对减少损伤大小和渗漏的作用[0308]方法[0309]根据以下设计，将非靶向siRNA阴性对照）、Wars2siRNA测试剂）和抗VEGFAb阳性对照玻璃体内施用于6-8周龄的棕色挪威雌性大鼠的眼睛中：[0310]第1天:双侧激光处理以产生每只眼三⑶个损伤[0311]第3天:双侧玻璃体内注射阴性对照、阳性对照或测试剂[0312]第22天:体内荧光素血管造影术[0313]第22天:摘出眼睛并固定以用于将来的组织学分析[0314]使用三⑶组，每组五⑶只大鼠，如表4所示。[0315]表4.激光诱导的CNV实验详情[0318]所有动物在标准动物护理条件下以三个一组饲养在保持于通风架中的大笼子中。[0319]麻醉[0320]利用20单位的氯胺酮（100mgml和100单位的甲苯噻嗪（20mgml，使用U-100注射器混合氯胺酮和甲苯噻嗪。通过IP注射以ΙμLg体重施加麻醉混合物。[0321]激光施加以产生CNV损伤[0322]用1%环戊通Cyclogyl溶液使动物扩瞳dilate并避光。在可观察到的扩张后，将动物用氯胺酮甲苯噻嗪镇静。使用MicronIII小动物眼底镜PhoenixResearch观察和记录镇静动物的眼底。使用通过MicronIII定制激光附件连接的热激光器进行激光处理。使用520nm的波长，每只眼睛设置总共3个损伤。记录和评价所得到的眼底图像以确认激光已经成功地通过布鲁赫膜Bruch'smembrane产生气泡。[0323]玻璃体内施用[0324]用氯胺酮甲苯噻嗪麻醉动物，并且表面施用Cyclogel和或托吡卡胺扩大瞳孔。在镇静和扩张后，使用Hamilton注射器和33号针以每只眼睛总体积5μ1在睫状体平坦部注射入玻璃体中。[0331]荧光素血管造影术[0332]用氯胺酮甲苯噻嗪麻醉动物，之后使其接受以ΙμL克体重IP注射的10%荧光素钠。然后使用MicronIII和用于488nm目标波长激发器屏障滤器将眼底图像捕获为8位TIFF文件。还为每只眼捕获标准彩色眼底照片。[0333]成像和损伤定量[0334]使用计算机化图像分析软件（ImageJ，NIH，USA对所有TIFF图像进行定量。然后手动free-hand单独追踪损伤，从而以像素量化区域，并且将彩色眼底照片用作损伤位置的参照。损伤中心的无血管化区域不包括在面积计算中。如果存在出血或两个损伤重叠，则将这些损伤排除在分析之外。[0335]组织收集[0336]用氯胺酮甲苯噻嗪（8010mgkg麻醉动物，然后通过IP施用200mgkg的Euthasol戊巴比妥使其安乐死。在安乐死后，摘出眼睛并单独固定在4%多聚甲醛中。在固定后，将所有眼睛储存在单独的2mL螺旋盖聚丙烯管中。将样品储存在室温下。[0337]数据和统计学分析[0338]用GraphpadPrism软件4.0版使用非配对t检验进行显著性的统计学分析。只有p值0.05的变化被认为具有统计学显著性。[0339]实施例14[0340]实施例13中进行的实验结果[0341]在激光处理后，阴性对照动物（即，注射有非靶向siRNA的那些）中，脉络膜新血管形成如预期进行。然而，在治疗性干预对照（抗VEGF抗体）和测试剂WARS2siRNA的情况下，观察到新血管形成的程度显著降低。[0342]实施例15[0343]WARS2敲低对人A549肺癌细胞数目的作用[0344]方法[0345]转染前一天，将A549肺癌细胞系ATCC目录:CCL-185在96孔板中以104个细胞孔培养。第二天，用非革巴向siRNA对照（SN001-10D，10nmo1，来自SingaporeAdvancedBiologiesPteLtd或人WARS2siRNA5'-CCGACATTCTGTTGTACAA-3'-SEQIDNO:36转染该细胞。按照LifeTechnologies用于其LipofectamineRNAiMAX方法的方案所述进行转染。[0346]在转染后2、4和5天，使用Cell_Tite:r-C51〇⑯发光细胞生存力测定Promega分析细胞数目。[0347]结果[0348]本研究证明，使用靶向WARS2的siRNA降低WARS2表达显著地减少了人A549肺癌中肺癌细胞的数目。如图26所示，非靶向siRNA没有作用，而在siRNA转染后仅两天就观察到细胞数目的显著减少，并且在转染后5天，数目减少了70%。因此，通过降低WARS2的表达减少或抑制了癌细胞的增殖。[0349]本文引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导均通过引用以其整体并入。[0350]尽管已经参照其示例性实施方案具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求涵盖的本发明范围的情况下，可以在形式和细节上进行多种改变。

权利要求：1.在有此需要的个体中调节血管发生的方法，其包括施用有效量的调节WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。2.权利要求1所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合，从而抑制血管发生。4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。6.权利要求4所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸siRNA和或吗啉代寡聚体。7.权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂增强WARS2表达，WARS2活性或其组合，从而增强血管发生。8.权利要求1、2或7所述的方法，其中所述试剂是指导WARS2表达的载体。9.在有此需要的个体中抑制血管发生的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。10.权利要求9所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。11.权利要求9或10所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。12.权利要求10所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。13.权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸siRNA和或吗啉代寡聚体。14.权利要求1至6或9至13中任一项所述的方法，其中所述个体患有视网膜病、黄斑变性、癌症、是肥胖的、或其组合。15.权利要求14所述的方法，其中所述视网膜病是糖尿病性视网膜病。16.权利要求14所述的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关的黄斑变性AMD。17.权利要求16所述的方法，其中所述AMD是湿性AMD或干性AMD。18.在有此需要的个体中治疗视网膜病的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。19.权利要求18所述的方法，其中所述视网膜病是糖尿病性视网膜病。20.在有此需要的个体中治疗黄斑变性的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。21.权利要求20所述的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关的黄斑变性AMD。22.权利要求21所述的方法，其中所述AMD是湿性AMD或干性AMD。23.权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。24.权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。25.权利要求24所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸siRNA和或吗啉代寡聚体。26.权利要求23所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。27.在有此需要的个体中抑制癌细胞增殖的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。28.权利要求27所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。29.权利要求27或28所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。30.权利要求28所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。31.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸siRNA和或吗啉代寡聚体。32.权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是肺癌细胞。33.在有此需要的个体中增强血管发生的方法，其包括施用有效量的增强WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。34.权利要求33所述的方法，其中所述试剂是核酸、或小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。35.权利要求33或34所述的方法，其中所述试剂是指导WARS2表达的载体。36.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WARS2活性包括与WARS、EPRS、GAPDH、RPL14a、或其组合的相互作用。37.在有此需要的个体中鉴定肿瘤的血管发生潜力的方法，其包括确定相比于对照的从所述个体获得的一个或更多个胞外囊泡EV和或其内含物中的WARS水平，其中与所述对照相比，所述一个或更多个EV和或其内含物中WARS水平的提高表明所述个体中的肿瘤具有低血管发生潜力，并且与所述对照相比，所述一个或更多个EV和或其内含物中WARS水平的降低表明所述个体中的肿瘤具有高血管发生潜力。38.权利要求37所述的方法，其中所述对照是从一个或更多个没有肿瘤的个体获得的一个或更多个EV中的WARS水平。39.权利要求37或38所述的方法，其还包括从所述个体获得包含所述一个或更多个EV的样品。40.权利要求39所述的方法，其中所述样品是所述个体的生物流体、所述个体的生物组织、或其组合。41.权利要求40所述的方法，其中所述生物流体是血或血浆。42.权利要求37至41中任一项所述的方法，其还包括从所述个体获得一个或更多个EV或其内含物。43.权利要求37至42中任一项所述的方法，其还包括基于所鉴定的肿瘤血管发生潜力治疗所述个体。44.权利要求43所述的方法，其中如果与对照相比，所述一个或更多个EV和或其内含物中的WARS水平降低，则用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂治疗所述个体。45.权利要求37至44中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个EV是外泌体。46.在患有心血管病症的个体中鉴定血管发生潜力的方法，其包括确定相比于对照的从所述个体获得的一个或更多个胞外囊泡EV和或其内含物中的WARS水平，其中与所述对照相比，所述一个或更多个EV和或其内含物中WARS水平的提高表明所述个体中的低血管发生潜力，并且与所述对照相比，所述一个或更多个EV和或其内含物中WARS水平的降低表明所述个体中的高血管发生潜力。47.权利要求46所述的方法，其中所述对照是从一个或更多个没有心血管病症的个体获得的一个或更多个EV中的WARS水平。48.权利要求46或47所述的方法，其还包括从所述个体获得包含所述一个或更多个EV的样品。49.权利要求48所述的方法，其中所述样品是所述个体的生物流体、所述个体的生物组织、或其组合。50.权利要求49所述的方法，其中所述生物流体是血或血浆。51.权利要求46至50中任一项所述的方法，其还包括从所述个体获得一个或更多个EV或其内含物。52.权利要求46至51中任一项所述的方法，其还包括基于所鉴定的心血管病症的血管发生潜力来治疗所述个体。53.权利要求52所述的方法，其中如果与对照相比，所述一个或更多个EV和或其内含物中的WARS水平提高，则用有效量的增强WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂治疗所述个体。54.权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个EV是外泌体。55.确定有此需要的个体是否会受益于抗血管发生治疗的方法，其包括：a对所述个体染色体1的全部或部分进行基因组分析，其中所述部分包含：TTCATATTCTGTCGAGACACCCATC[CG]CCCTGTGTTTCACTTGTCTGATTACSEQIDNO:38;并且b检测SEQIDNO:38的26位处的至少一个等位基因，其中如果至少一个等位基因在SEQIDNO:38的26位处是G，则所述个体将受益于抗血管发生治疗。56.权利要求55所述的方法，其中所述个体在所述等位基因处是G纯合的G:G，在所述等位基因处是G杂合的6:0或在所述等位基因处是C纯合的C:C。57.权利要求55或56所述的方法，其中染色体1的所述部分包含染色体1的119,503，593-119,504,093位。58.权利要求55至57中任一项所述的方法，其中将来自所述个体SEQIDN0:38的26位处的所述至少一个等位基因的检测与对照进行比较。59.权利要求58所述的方法，其中所述对照获自响应于抗血管发生治疗、不响应于抗血管发生治疗的一个或更多个个体或其组合。60.权利要求55至59中任一项所述的方法，其中所述个体患有肿瘤。61.权利要求55至60中任一项所述的方法，其还包括从所述个体获得样品。62.权利要求61任一项所述的方法，其中所述样品获自所述个体的生物流体、所述个体的生物组织、或其组合。63.权利要求62所述的方法，其中所述生物流体是血或血浆。64.权利要求55至63中任一项所述的方法，其还包括用抗血管发生治疗来治疗在SEQIDN0:38的26位处具有至少一个为G的等位基因的个体。65.权利要求64所述的方法，其中所述抗血管发生治疗包括抑制血管内皮生长因子VEGF、VEGF受体2VEGFR、血小板衍生生长因子PDGF、Tie-l受体Tie-1R、Tie-2受体Tie-2R、胎盘生长因子P1GF、VE-钙黏着蛋白、或其组合。66.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体是人。67.鉴定调节WARS表达、活性或其组合之试剂的方法，其包括：a测定从已经与待评估的试剂接触的细胞、组织和或生物体获得的一个或更多个胞外囊泡EV的WARS表达和或活性;并且b将a中所述的WARS表达、活性或其组合与对照进行比较，其中如果与所述对照相比，在所述试剂存在下WARS表达、活性或其组合改变，则所述试剂调节WARS表达、活性或其组合。68.权利要求67所述的方法，其中所述对照是不存在所述药剂时的EV的WARS表达、活性或其组合。69.权利要求67或68所述的方法，其中与所述对照相比，在所述试剂存在下所述EV的WARS表达、活性或其组合降低。70.权利要求67或68所述的方法，其中与所述对照相比，在所述试剂存在下所述EV的WARS表达，活性或其组合提高。71.权利要求67至70中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞、组织和或生物体与待评估的试剂接触。72.权利要求67至71中任一项所述的方法，其还包括从已经与待评估的试剂接触的所述细胞、组织和或生物体获得所述一个或更多个EV。73.权利要求67至72中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个EV是外泌体。

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