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申请/专利权人：促进军事医学的亨利·M·杰克逊基金会公司;班扬生物标记公司

摘要：危及生命的创伤如恐怖袭击、战争、灾难、精神打击或身体攻击、严重事故和暴力经常激起称为创伤后应激障碍PTSD和与其相关的自杀的情绪和行为障碍。用于PTSD和自杀的准确的诊断和治疗计划仍然是困难的。特异性标志物的发现为鉴定当进行干预时可以经历更好结果的组的更准确的临床评估创造新的机会。本发明提供了在怀疑患有PTSD和或具有自杀倾向的对象的生物样品中检测P‑11、UBE3A、STY1、EMAP‑II、SIP1、ORC5L、DCX、SCYE蛋白的方法，以及提供对性别具有特异性的其它PTSD标志物。

主权项：1.一种泛素蛋白连接酶E3AUBE3A在制备用于确定创伤后应激障碍PTSD存在的试剂盒中的用途，包括：基于从对象中获得的生物样品中测量的UBE3A的量，确定怀疑患有PTSD的对象中PTSD的存在。

全文数据：检测和监测用于PTSD的诊断生物标志物以及区分自杀式与非自杀式障碍的方法和试剂盒[0001]本申请为申请日是2012年9月14日、申请号是201280044530.5、发明创造名称是“用于检测和监测用于创伤后应激障碍PTSD的诊断生物标志物以及用于区分自杀式与非自杀式障碍的方法和试剂盒”的发明专利申请的分案申请。[0002]相关申请的交叉参考[0003]本申请要求2011年9月14日提交的美国临时专利申请号61534,560和2011年12月11日递交的美国临时专利申请号61569,047的优先权。每个相关申请在这里通过参考并入。[0004]政府支持[0005]本发明是在美国陆军U.S.Army给予的DAMD17-00-1-0110号资助以及国家心理健康研究所NationalInstituteofMentalHealth给予的02-M-0317号资助下由政府支持作出的。政府对本发明具有一定的权利。技术领域[0006]本发明基本涉及在患有创伤后应激障碍post-traumaticstressdisorder，PTSD的对象中产生的标志物的可靠的检测和鉴定并提供用于在患有该障碍的对象中区分自杀与非自杀式神经病理学的可靠的衡量标准。特别地，本发明涉及用于检测PTSD及自杀的方法和试剂盒以及用于患有该障碍的患者的治疗和给药的方法。此外，本发明提供一种体外诊断装置，其使对于PTSD和自杀的诊断和预后重要的标志物的可靠的检测和鉴定成为可能。背景技术[0007]创伤后应激障碍Post-TraumaticStressDisorder，PTSD影响了7-8%的美国总人口以及约15%的从战争返回的退伍军人。症状可以持续数月或数十年。不幸的是，在患病的平民和军人个体中PTSD经常被误诊以及放任不治疗，扰乱他们的生活质量、他们的家庭和孩子、以及我们的医疗保健系统。即使确诊时，PTSD进程的严重程度仍然难以治疗。尽管这种障碍的神经生物学相关性的广泛研究，以及努力去了解潜在的病理学，这种疾病的细胞和分子机制仍然知之甚少。[0008]PTSD是一种严重致残焦虑症，可以在对象看到或经历涉及伤害或死亡威胁的创伤性事件后出现，可以在临床上以急性或慢性形式被发现。有关的创伤性经历包括经历或目睹儿童虐待、交通事故、内科合并症、身体攻击、自然灾害、入狱或战争。PTSD的症状包括噩梦连连或白天回闪的侵袭，特点是高度焦虑;过度警觉，意为用于战斗或逃跑的持续跳动准备；以及避免与可能提醒患者创伤的任何东西或任何人接触。急性PTSD可能在3-6个月内消退，然而，慢性PTSD是一种消长疾病，可以持续几个月、几年、或几十年。PTSD往往与其他精神疾病特别是抑郁、物质滥用和自杀想法并存。因此，PTSD可能导致严重残疾。[0009]PTSD的目前的诊断建立在临床病史和对象精神状态检查的基础上，采用临床结构性访谈、症状检查表、或病人自我报告。然而，采用这些对象测试，仍然难以区分PTSD和其他精神疾病，导致关于治疗干预和病因学的更加明确的了解两方面的困难的治疗决定。目前的临床评估存在的限制将大大受益于更加客观的装置，以提尚鉴定PTSD患者的能力，并因此能够将PTSD与其他精神疾病区分开。[0010]自杀是所有年龄段死亡的十大主要原因之一，也是15-34岁的人死亡的前三个原因之一。自杀倾向以及这些倾向的进程是非常难以诊断的。通常自杀倾向只能通过精神状态检查进行预防性诊断，但更普遍是在自杀企图作出后。自杀是一个具有挑战性的心理健康问题，因为所有主要的精神障碍增加自杀的风险。精神疾病，如BP、MDD、SCZ或PTSD，存在于大约90%的进行自杀的人中，并导致大多数人处于自杀的危险中。在自杀牺牲者中在他们死亡时这些精神障碍的发生率为87.3%〜98%。[0011]许多风险因素增加PTSD患者企图自杀的机会，这些因素包括：1多次住院，2抑郁，3在PTSD发病前存在应激生活事件，4在PTSD发病时比较年轻，5PTSD症状发作之间没有空闲间隔期，6雌性，7性行为，8PTSD症状先前发作的更多次数，和9循环情绪性格。这些特征已经常规使用于企图鉴定那些整个过程处于较高的自杀风险的人们。[0012]预防自杀已成为军事组织的另一个主要问题。单单在美国陆军，自杀的发生率在目前的经济危机以及伊拉克和阿富汗战争期间一直稳步上升。虽然已经花费很多努力在努力理解能够增加自杀风险的生物因素，以及鉴定发生在那些具有自我伤害倾向的人们中的生物学改变中，目前，没有客观的生物学标志物以防止自杀。PTSD的最近研究发现在PTSD患者中自杀和自杀企图的大幅增加的风险。62%的诊断为PTSD的个体具有自杀构想，因为创伤性事件普遍增加个人的自杀风险。患有PTSD的个体的自杀企图的可能性比不患有它的个体大约高15倍。因而存在确定患有PTSD的患者的自杀风险的需要。[0013]用于PTSD的治疗包括心理治疗，特别是认知行为治疗和辅助药物治疗，主要采用特异性血清素重吸收抑制剂（serotonin-specificreuptakeinhibitor，SSRI’s。已经研究了许多不同的药理学方法。一种方法是基于临床假设，即重度抑郁症MajorDepressiveDisorder，MDD和PTSD可能具有很多共同点。例如，这些存在享有共同的风险因素，具有重叠的症状，并经常一起出现。因此，广泛认为抗抑郁药，如SSRI药物氟西汀（百忧解）fluoxetineProzac和帕罗西汀赛乐特）（paroxetinePaxil，在治疗PTSD的一些症状中是有效的。其它通常施用的SSRI抗抑郁药包括文拉法辛（怡诺思）（venlafaxineEffexor和舍曲林佐洛复）（sertralineZoloft。[0014]然而，PTSD患者可能还有其它共存或并存的临床问题。这些并存状况已经导致其它类型的药物添加到医疗设备中。通常施用的抗精神病药物包括米氮平（瑞美隆）mirtazapineRemeron、奥氮平（再普乐）（olanzapineZyprexa和喹硫平（思瑞康）quetiapioneSeroquel。还使用β受体阻滞剂普萘洛尔（propranolol用于试图阻断PTSD患者中记忆的形成。已经报道昵唑嗪Prazosin，一种Ct1-选择性肾上腺素受体拮抗剂，减少与PTSD相关的创伤有关的恶梦和睡眠障碍。因此，共病，无论是因果关系或补偿性的，可能使得PTSD药物治疗的可能方法变得复杂。这些问题暗示可能需要用于PTSD的更加客观的、基于生物学的标准。[0015]虽然一直努力开发临床策略以鉴定PTSD患者，但是目前还没有用于在患者中检测这种风险的生物测定方法。因此，PTSD患者的诊断只建立在临床病史和精神状态检查的基础上，通常采用临床结构性访谈、症状检查表和病人自我报告。目前的临床评估将大大受益于更加客观的测试。[0016]生物标志物越来越多地使用用于及时和准确地诊断疾病，以及甚至在临床表现出现之前，鉴定处于某些疾病和倾向的高风险的个体。目前没有客观的标志物来验证PTSD的诊断或作为用于PTSD治疗的客观替代指标。在没有用于PTSD患者的临床使用的标志物的情况下，诊断一直依赖于主观临床评估，或来自心理学家的无症状诊断。因为PTSD只能通过患者的个人访谈进行诊断，其中患者可能认识到给出他们知道正确的答案，目前的方法使得难以诊断患有这些疾病的对象。其结果是，在数千名患病的个体中，经常遗漏、误诊或放任不治疗大多数PTSD病例。在遗漏这些疾病的某些情况中，公众的安全也受到危害。[0017]尽管当今的标志物分析的技术，对于能够帮助精神疾病例如PTSD、MDD、SCZ和BP的客观检测的预后指标，仍存在未满足的需要。此外，在诊断那些处于自杀风险的患者时，存在提供将有助于鉴定那些患有精神疾病的患者的衡量标准的需要。此外，存在客观地诊断PTSD的方法的需要，客观地监测PTSD进程和预防自杀的需要，在临床表现前检测PTSD的方法的需要，以及通过使用体外诊断装置以鉴定神经化学标志物从而指导恰当的治疗疗程的临床干预的需要。发明内容[0018]提供了一种诊断工具，用于创伤后应激障碍Post-traumaticstressdisorder，PTSD和或自杀单独的或与基于访谈的评估或用于其它疾病例如MDD、SCZ和BP的其它生物标志物水平结合的临床评价。此外，通过使用标志物，提供了提高PTSD和自杀风险评估的客观的衡量标准。经过反复测试，关于生活方式或药物治疗方案的有效性提供了反馈。[0019]本发明进一步提供了专门设计和校准以检测在患有精神疾病例如PTSD、MDD、SCZ、BP和自杀的患者的样品中差异存在的神经元蛋白标志物的体外诊断装置。这些装置提出了灵敏、快速、非侵入性的方法用于通过检测和确定表明精神疾病的标志物的量以帮助精神疾病的诊断。在患者样品中这些标志物的测量，单独或与患者访谈结合，提供诊断医师能够关联某个精神疾病的严重程度的可能的诊断的信息。[0020]本发明进一步提供了用于PTSD检测的检测性别特异和非性别特异的蛋白的方法。代表性的PTSD标志物是选自：突触结合蛋白Isynaptotagmin1，泛素蛋白连接酶E3AubiquitinproteinligaseE3A，聚合酶（以DNA为模板的），Δ1，催化亚基125kDapolymeraseDNAdirected，deltal，catalyticsubunit125kDa，微小诱导细胞因子亚家族E，成员1内皮单核细胞激活的）（smallinduciblecytokinesubfamilyE，memberIendothialmonocyte-activating，非车专移细胞I蛋白（Nm23Anon-metastaticcellsIproteinNm23A，蛋白激酶C-类似物I，核蛋白，共济失调-毛细血管扩张症位点proteinkinaseC-IikeI,nuclearprotein,ataxia-telangiectasialocus，单克隆抗体KI-87鉴定的抗原，磷脂酶C，βI磷酸肌醇特异性的）（phosphoIipaseC，betaIphosphoinositide-specific，电压门控钾通道，亚家族Heag相关的），成员6potassiumvoltage-gatedchannel,andsubfamilyHeag-related,member6,P-Il和P2RX7的PTSD特异性的至少一个、多个或所有性别中性蛋白、其肽、变体或片段。标志物P-1和P2RX还可以使用用于确定自杀患者。[0021]代表性的雄性特异性PTSD标志物是选自：泛素结合酶E2L3Ubiquitin-conjugatingenzymeE2L3，FAS相关死亡结构域蛋白（FasTNFRSF6-associatedviadeathdomain，蛋白激酶，AMP激活的，βΐ非催化亚基proteinkinase，AMPactivated，betaInon-catalyticsubunit，激肽释放酶10kallikrein10，丝裂原活化蛋白激酶4mitogen-activatedproteinkinase4，TAF6RNA聚合酶II，TATA框结合蛋白（TBP-相关因子，80kDaTATAboxbindingproteinTBP-associatedfactor，80kDa，蛋白激酶C，ctproteinkinaseC，alpha，DNA断裂因子，45kDa，c[多肽（DNAfragmentationfactor，45kDa，alphapolypeptide，三角形四肽重复干扰素诱导蛋白4interferon-inducedproteinwithtetratricopeptiderepeats4，纹蛋白、f丐调素结合蛋白striatin，calmodulinbindingprotein，磷酸肌醇-3-激酶，催化c[多肽phosphoinositide-3_kinase，catalyticalphapolypeptide，肿瘤坏死因子受体，超家方矣，成员6tumornecrosisfactorreceptor，superfamily，member6，核自身抗原精子蛋白（组蛋白结合的）（nuclearautoantigenicspermproteinhistonebinding，ras同源基因家方矣，成员Arashomologgenefamily，memberA，NIMAneverinmitosisgenea相关激酶2NIMAneverinmitosisgenea_relatedkinase2，SWISNF相关的，基质相关的，染色质肌动蛋白依赖性调节子，亚家族a，成员2SWISNFrelated，matrixassociated?actindependentregulatorofchromatin，subfamilya，member2，芳香径受体核转位蛋白（arylhydrocarbonreceptornucleartranslocator，突触相关膜蛋白，91kDa同源物（小鼠）（synaptosomal-associatedprotein，91kDahomologmouse，G1向S期转换蛋白2G1toSphasetransition2和整合素，a2CD49B，VLA-2受体的a2亚基）（integrin，alpha2CD49B，alpha2subunitofVLA_2receptor的PTSD特异性的至少一个、多个或所有雄性特异性蛋白、其肽、变体或片段。[0022]代表性的雌性特异性PTSD标志物是选自：运动神经元存活蛋白结合蛋白1survivalofmotorneuronproteininteractingproteinI，桥粒斑菲素蛋白2plakophilin2，分泌蛋白SEC8secretoryproteinSEC8，表皮生长因子受体通路底物8epidermalgrowthfactorreceptorpathwaysubstrate8，二酉先基甘油激酉每，ΘIlOkDadiacylglycerolkinase，thetaIIOkDa，中心体相关蛋白2centrosomalprotein2，通用转录因子IIF，多肽2,30kDageneraltranscriptionfactorIIF，polypeptide2,30kDa，神经源素3neurogenin3，和ADP-核糖转移酶NAD+，聚（ADP-核糖）聚合酶）（ADP-ribosyltransferaseNAD+;polyADP-ribosepolymerase的PTSD特异性的至少一个、多个或所有雌性特异性蛋白、其肽、变体或片段。[0023]还提供了方法，以检测在全血、CNS组织、血清、血浆、脑脊液、唾液、汗液、泪液、尿、口腔样品、或它们的组合物中的P-Il膜联蛋白II轻链annexinIIlightchain的蛋白或mRNA，泛素蛋白连接酶E3AUbiquitinproteinligaseE3AUBE3A，突触结合蛋白SynaptotagminSTYl，内皮单核细胞激活多肽（endothelialmonocyte-activatingpolypeptideEMAP-II，运动神经元存活蛋白结合蛋白（survivalofmotorneuronproteininteractingproteinSIPI，起始识别复合物，亚基5-类似物（Originrecognitioncomplex，subunit5-like0RC5L和双皮质；无脑回畸形，X-连锁双皮质素）（DCXDoublecortex;lissencephaly，X-linkeddoublecortinDCX的水平；并将蛋白的测量水平与没有患有这些标志物表明任何精神或神经疾病状态的健康正常对象的该蛋白的测量水平进行比较;或可选地，来自个体的历史水平提供对比物。PTSD、自杀或其它上述疾病的诊断是当从对象采集的样品中的所选择的标志物的水平超出预先选择的正常范围时。对于给定的对象的正常范围是根据患者的具体的变量，举例包括年龄、性别、药物负荷medicationloading，以及基于访谈的诊断而进行选择的。进一步地，性别特异性的标志物进行了说明。[0024]检测这些蛋白的方法是通过常规的免疫测定技术如蛋白免疫印迹（westernblot或酶联免疫吸附测定Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA进行的，但优选通过使用夹心ELISA法。另外，使用用于检测蛋白抗原或蛋白分解产物的试剂如抗体。[0025]可以理解，使用针对上述标志物的抗原以检测身体的自身抗体反应。任一试剂的使用使得对象中测量的标志物的量的检测成为可能，提供用于检测PTSD存在并确定患者的PTSD诱导的自杀倾向的衡量标准。[0026]还使用在外周血单核细胞peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs中的P-IlmRNA以检测PTSD和其它精神疾病，例如MDD，以充分了解精神疾病的进程。这里检测的优选方法是通过定量实时聚合酶链式反应（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，Q-PCR进行的，其测量来自PTSD、MDD和自杀对象的I3BMCs中标志物的mRNA水平。该方法涉及测量对象的I3BMCs中P-IImRNA水平，并与来自健康个体或非精神病患者以及PTSD或MDD的非自杀患者的样品中P-IlmRNA的表达水平比较。[0027]在患者样品中的P-Il蛋白水平容易地在临床或现场环境中在手持或即时护理平台上基本上实时地进行检测。可以理解，P-IlmRNA单独或与伴随P-Il蛋白的标志物相结合进行测量。通过使用任一上述这些技术，对于患者来说，检测到的显著低于正常的P-Il的水平mRNA或蛋白）表明那些患有自杀式PTSD的患者。如果检测到的P-Il的水平高于正常，该水平表明非自杀式PTSD、BP、MDD或SCZ。关于适于对象的治疗方案的评估是基于从对象获得的生物样品中P-Il的测量水平进行选择的。经济报酬可以要求换取P-Il蛋白水平或其它发明标志物的测量。至少一个所述标志物单独或与在这里描述的其它PTSD标志物结合进行测量。[0028]进一步可以理解，对于所讨论的具体疾病，精神疾病诊断的类型主观地通过互补的精神评估或客观地通过使用其它标志物进一步精确。通过举例的方式，可以使用P2RX7蛋白，P2RX7mRNA水平或UBE3A用于诊断的精确，提供患者中PTSD和自杀的另外的指示预测因子，进一步帮助PTSD与其它精神疾病的区分。应当理解，鉴定的两个或更多个标志物的使用提供协同的诊断测试，以准确地协助对象中自杀和或PTSD的检测。附图说明[0029]图1示出用于泛素蛋白连接酶E3AUBE3A的受试者操作特征（receiveroperatingcharacteristic，R0C曲线，其中，对于男性male和女性female患者，AUC均为100%〇[0030]图2示出用于突触结合蛋白ISTYl的ROC曲线，其中，对于男性，AUC为95%，对于女性，AUC为88.8%。[0031]图3示出用于微小诱导细胞因子亚家族ESCYEl的ROC曲线，其中，对于男性，AUC为98.1%，对于女性，AUC为97.9%。[0032]图4示出用于在对照和PTSD患者之间限定的发明标志物的ROC曲线，其中，对于样本的统计数据，AUC是88%。[0033]图5显示血浆皮质醇的基础水平在PTSDη=13和对照对象η=11之间没有显著差异Ρ0.05。[0034]图6显不糖皮质激素受体glucocorticoidreceptor，GR的mRNA水平在PTSD的PBMCs中显著低于对照对象。[0035]图7示出，与对照（n=14相比，在PTSD患者中显著较低的P-IlmRNA水平（P10-4,假阳性率0.05。[0142]图6显示GRmRNA水平在PTSD的PBMCs中比对照对象显著降低。[0143]图7显示与对照n=14相比，在患有PTSD的患者n=13中显著较低的P-IlmRNA水平。（Ρ0·05。躁郁症，BPη=24、重度抑郁症，MDDη=24、精神分裂症，SCZη=12的PBMCP-IlmRNA水平显著高于对照对象η=14Ρ0.001。[0144]发现这里详述的在mRNA水平中的这些趋势与从对象采集的其它样品关联;其它样品包括脑脊髓液CSF、血浆、血清、尿液和唾液。通过对用于测试mRNA水平的样品的等分试样采用ELISA法测量蛋白水平，也证实P-11蛋白和P2RX7蛋白水平具有如用于mRNA的上述详细描述的趋势。[0145]例3[0146]本发明的对化学和治疗药物干预有效性提供反馈的能力提供在这个例子中，其中生物样品从总共49个对象获得。14个对象确定为患有PTSD，其中9个是自杀性的，其余5个是非自杀性的。21个对象确定为患有BP，其中7个是自杀性的，其余14个是非自杀性的。其余的14个对象是健康对照对象。对于性别没有显著组间差异见表6。在年龄、性别比例、教育程度或婚姻状况方面，BP或PTSD患者和对照对象之间无统计学显著差异。表6显示，BP和PTSD患者，有和没有自杀企图，分别具有类似的平均发病年龄。[0147]所有PTSD对象用药物治疗，66%的患PTSD的企图自杀者服用利福全氯硝西泮，一种苯二氮）（rivotrilClonazepam，abenzodiazepine，而55%服用德巴金（depakine。22%服用欣百达（cymbalta、恋多眠（Iendormin、美得眠（modipanol、舒眠诺思（semi-nax或赛乐特seroxat。11%服用赛乐特、安立复abilify、安克痉akineton、安定文ativan、怡诺思（effexor、卩坐替平（Iodopin、ni1、奥氮平（olanzapine、瑞美隆remeron、神宁健（sinequan、思诺思（stiInox、特定脑（tryptanol、威博隽welIbutrin或赞安诺xanax〇[0148]60%的患PTSD的非自杀患者服用愈利舒盼（erispan，而40%服用怡诺思或思诺思。20%服用安立复、德巴金、心得安（Inderal、恋多眠、美舒郁mesyrel、nil、利福全或赛乐特。没有BP患者用药物治疗。[0149]表6:患BP或PTSD的企图自杀者和非自杀患者和对照对象的统计数据。[0150][0151]NS，不显著[0152]测试对象的诊断由两位精神病医生使用简明国际神经精神访谈（MiniInternationalNeuropsychiatricInterview，MINI和DSM-IV为所有研究对象进行确定。所有患者均符合用于BP或PTSD的DSM-IV诊断标准。排除标准是当前的医疗问题，严重身体疾病，神经系统疾病，头部创伤伴随意识丧失的历史，物质滥用的历史和目前的酒精滥用6个月内）。非精神病对照对象和PTSD和BP患者在年龄、性别、教育和种族上匹配为一组。企图自杀者的一生历史通过使用半结构式访谈并结合病历回顾进行评估。[0153]为了定量情绪和焦虑症状的临床结果，分别使用汉密尔顿抑郁量表HamiltonRatingScaleforDepression，HAMD和汉密尔顿焦虑量表（HamiltonAnxietyScale，HARS〇[0154]肝素化和非肝素化血液样品（各10毫升通过静脉穿刺在真空采血管中采集。外周血单核细胞PBMCs通过葡聚糖泛影葡胺Ficoll-HypaqueInvitrogen公司）密度梯度离心分离。血液样品储存在-80°C。[0155]全血样品在1300xg下在4度离心10分钟。然后将血浆转移到标记的清洁的Eppendorf管中并储存于-80cC13P-Il的血浆水平由高度敏感的ELISA测定。使用单克隆抗-人-P-Il抗体。P-Il的浓度从用于在每个测定中在相似条件下绘制的P-Il标准曲线的回归线确定。[0156]使用PAXgenbloodRNAvalidationKitPreAnalytiXaQiagenBDcompany，Valencia，CA从人血裂解物中提取RNA。使用SuperscriptIIIRT逆转录酶和寡聚dT引物（Invitrogen从3毫克总RNA生成cDNA。对生成的cDNA产物在IQ5序列检测系统（IQ5sequencedetectionsystem中使用SYBRGreenBio-Rad公司）进行实时PCR。下面的序列使用用于人P-IlmRNA分析:正向SAAATTCGCTGGGGATAAAGG-SlSEQ.ID.NO.l和反向5'AGCCCACTTTGCCATCTCTA-3SEQ.ID.N0.2引物。用于P2RX7mRNA分析的序列是正向5'AGATCGTGGAGAATGGAGTG-3'SEQ.ID.N0.3和反向5'-TTCTCGTGGTGTAGTTGTGG-3'SEQ.ID.N0.4引物。在对照和实验样品中β-actinmRNA的水平使用作为内部参照，用于标准化P-11或P2RX7mRNA水平。用于β-actin引物的序列是5-ACCTGTACGCCAACACAGTG-3SEQ.ID.N0.5和S'-ACACGGAGTACTTGCGCTCA-SYSEQ.ID.NO.eAppliedBiosystems。稀释曲线使用用于确认阈值循环数对模板RNA的浓度的线性依赖性。[0157]在对照和实验样品中P-11或P2RX7mRNA的相对定量使用标准曲线方法获得。[0158]所有数据以平均数土标准偏差给出。在患PTSD、BP的企图自杀者和非自杀患者和对照对象之间PBMCP-Il或P2RX7表达的差异通过单因素方差分析one-wayAN0VA进行分析。还进行了相关系数和P值的分析。使用GraphPadPrismGraphPadSoftware，Inc.SanDiego，CA、SPSSSPSSInc.Chicago，Illinois和MicrosoftExcel进行统计。[0159]对每个样品测量PBMCP-IlmRNA和P2RX7mRNA的表达水平，并对结果进行比较。[0160]图8A证明对照对象、患PTSD的企图自杀者和非自杀患者中PBMCP-IlmRNA表达水平的差异。实时PCR数据表明对于具有BP的PBMC中P-IlmRNA水平在组间的显著差异。患PTSD的企图自杀者比对照对象和非自杀患者具有显著更低水平的PBMCs中的P-IImRNA。[0161]图8B证明对照对象、患BP的企图自杀者和非自杀患者中I3BMCP-11表达水平的差异。实时PCR数据表明对于PBMC中P-11mRNA水平在组间的显著差异。企图自杀者和非自杀患者均比对照对象具有显著更高水平的PBMCs中的P-IlmRNA，而在企图自杀者和非自杀患者之间在P-IlmRNA水平上没有显著差异。[0162]在药物治疗组中在有或没有自杀企图的患者中，PBMCP-IlmRNA的表达水平不再与PTSD的症状关联。在具有通过汉密尔顿量表测量抑郁量表HAMD和汉密尔顿焦虑量表HARS测量的抑郁和焦虑的PTSD患者中进行P-11水平的相关分析。在患PTSD的企图自杀者图9A-B或非自杀患者图9C-D中，PBMCP-IlmRNA的表达与HAMD或HARS分数不相关。[0163]在药物治疗组中在有或没有自杀企图的患者中，PBMCP-IlmRNA的表达水平不再与BP的症状关联。在具有通过HAMD和HARS测量的抑郁和焦虑的BP患者中进行P-Il水平的相关分析。在患BP的企图自杀者（图10A-B或非自杀患者（图10C-D中，PBMCP-IlmRNA的表达与HAMD或HARS分数不再相关。[0164]有无自杀企图的PTSD患者和没有企图的BP患者的PBMCP2RX7mRNA的表达水平显著低于对照对象的PBMCP2RX7mRNA的表达水平。图IIA证明在对照对象和有无自杀企图的PTSD患者中PBMCP2RX7表达水平的差异。实时PCR数据表明对于PBMC中P2RX7mRNA水平在组间的显著差异。患有PTSD的企图自杀者和非自杀患者均比对照具有显著更低水平的PBMCs中的P2RX7mRNA。[0165]图IIB证明在对照对象、患BP的企图自杀者和非自杀患者中PBMCP2RX7表达水平的差异。实时PCR数据表明，与对照对象和具有自杀企图的BP患者相比，无自杀企图的BP患者具有显著更低水平的PBMCs中的P2RX7mRNA。[0166]PBMCP2RX7mRNA的表达水平与患有PTSD的非自杀患者（图12C-D而不是企图自杀者（图12A-B的症状是尚度相关的。[0167]I3BMCP2RX7mRNA的表达水平与有无自杀企图的BP患者的症状不相关。有无自杀企图的BP患者的PBMCs中P2RX7mRNA水平与HAMD或HARS分数不显著相关（图13。[0168]发现这里详述的在mRNA水平中的这些趋势与从对象采集的其它样品关联;其它样品包括脑脊髓液CSF、血浆、血清、尿液和唾液。通过对用于测试mRNA水平的样品的等分试样采用ELISA法测量蛋白水平，也证实P-11蛋白和P2RX7蛋白水平具有如用于mRNA的上述详细描述的趋势。[0169]例4[0170]生物样品是从诊断患有PTSDη=14或MDDη=12和14例正常对照的40名对象获得的。11名精神病患者曾试图自杀。可用的临床记录，包括住院和门诊，进行回顾，所有对象都经过精心访谈有关精神病史、精神疾病的家族史、物质滥用史。诊断由两位精神病医生使用简明国际神经精神访谈MiniInternationalNeuropsychiatricInterviewMINI和DSM-IV对所有研究对象进行确定。所有患者均符合用于PTSD或MDD的DSM-IV诊断标准。排除标准是当前的医疗问题，严重身体疾病，神经系统疾病，头部创伤伴随意识丧失的历史，物质滥用的历史和目前的酒精滥用6个月内）。正常对照与PTSD和MDD患者在年龄、性别、教育和种族上匹配为一组。[0171]在研究设计已经充分解释之后，以及在接受精神评估和采血前，提供所有对象书面知情同意书。企图自杀者的一生历史是通过使用半结构式访谈并结合病历回顾进行评估。用于每个组的临床诊断显示于表7中。结果表明，曾企图自杀n=ll和曾没有企图自杀的n=15患者的年龄之间没有统计学上的显著差异。由所有组使用的药物显示于表8中。[0172]表7:企图自杀者、非企图自杀者和对照的统计数据。[0173][0174]表8:企图自杀者和非企图自杀者中的药物。[0175][0177]使用来自斯坦利医学研究所StanleyMedicalResearchInstitute，SMRI的3个死后大脑采集标本，包括神经病理学组（NeuropathologyConsortium、矩阵组ArrayCollection、及抑郁组DepressionCohort。对象在年龄、性别、种族、大脑pH表9、死后间隔（post-morteminterval，PMI、大脑侧和mRNA质量上匹配。使用背外侧前额皮质dorsolateralprefrontalcortex，PFC用于所有微阵列研究。RNA处理实验方案由微阵列制造商Affymetrix推荐。对于自杀的分析，对象分成两组，包括那些进行过自杀的患精神病的对象n=56和无精神疾病的正常对照n=61。精神疾病和药物治疗效果在个体研究分析中使用多元回归模型进行了调整。[0178]表9:非自杀对照和自杀对象的统计数据。「01791[0180]所有的微阵列的原始数据使用MAS5.0归一化算法进行转换。在进行统计分析之前进行一系列质量控制qualitycontrol，QC分析以鉴定微矩阵样品异常值。简单地说，每个微阵列芯片采用用于芯片级参数例如比例因子、探针完美匹配不匹配差异计数、存在访问百分数、对照基因（GAPDH和i3-actin5030比例、以及相对于用于整个阵列的那些参数的参考分布的平均相关性的AfTymetrixQC衡量标准进行衡量。[0181]对于个体研究分析，通过在每项研究中使用线性模型，评估每个统计和临床变量以鉴定潜在的混杂因素。这些统计数据分析之后，对自杀组进行分析，以鉴定因混杂因素调整的区别基因的列表。多元回归分析为每个研究中的每个基因提供调整后的倍数变化、标准误差（SE、以及p值。对于交叉研究分析，包括Affymetrix微矩阵研究研究IDs:1、2、3、4、5、7、14、15和21。交叉研究的比较基于研究中个体研究水平的比例图像显示以提取生物模式和关系。基于个体倍数变化和用于定位至所有研究中每个基因的Affymetrix探针组的SEs的加权组合为每个基因计算共有的倍数变化。以探针特异性方式确定权重来解释与定位至所有平台中给定基因的每个探针组相关的不同精度等级。权重等于1个SEs，其中SEi是用于所有研究的基因的第i个探针组的标准误差。[0182]为了定量情绪和焦虑症状的临床表现，分别使用汉密尔顿抑郁量表HAMD和汉密尔顿焦虑量表HARS。[0183]肝素化和非肝素化血液样品（各10毫升通过静脉穿刺在真空采血管中采集。外周血单核细胞通过葡聚糖泛影葡胺Ficoll-HypaqueInvitrogen公司）密度梯度离心分离。血液样品储存在-80°C。[0184]实时PCR分析的P-Il或P2RX7基因表达RNA使用PAXgenbloodRNAvalidationKitPreAnalytiX，QiagenBDCompany，Valencia，CA从人血裂解物中提取。使用SuperscriptIIIRT逆转录酶和寡聚（dT引物（Invitrogen从3毫克总RNA生成cDNA。生成的cDNA产物在IQ5序列检测系统（IQ5sequencedetectionsystem中使用SYBRGreenBio-Rad公司）进行实时PCR。使用例3的序列SEQIDNOs1-6用于分析。稀释曲线确认阈值循环数对模板RNA的浓度的线性依赖性。在对照和实验样品中P-11或P2RX7mRNA的相对定量使用标准曲线方法获得。[0185]所有数据以平均S.D或S.E给出。在曾企图自杀的患者、曾没有企图自杀的患者和对照对象之间PBMCP-Il或P2RX7表达水平的差异通过单因素方差分析one-wayAN0VA进行分析。还使用MicrosoftExcel进行了相关系数和P值的分析。使用GraphPadPrismGraphPadSoftware，Inc.SanDiego，CA进行统计。[0186]在企图自杀者的PBMCs中和在自杀死亡者的PFC中的P-IlmRNA表达水平的差异，在对照对象、企图自杀者和非企图自杀者的I3BMCs中的P-IlmRNA水平显示在图10中。与对照对象相比，P-IlmRNA水平在企图自杀者中显著下降，而在非企图自杀者中P-IlmRNA水平显著高于对照对象或企图自杀者。[0187]企图自杀者和非企图自杀中的HAMD和HARS分数和P-IlmRNA水平的相关性进行了研究。药物治疗企图自杀者中的HAMD或HARS和P-IlmRNA水平之间没有显著相关性。然而，在药物治疗企图自杀者和非企图自杀者中的HARS分数之间具有显著差异。最后，在药物治疗企图自杀者和药物治疗非企图自杀者之间的HAMD分数的第3项评分之间具有显著差异。这些结果对相对于没有药物治疗PTSD对象治疗作为整体在改变标志物水平中的功效提供反馈。[0188]如图11所示，与对照对象相比，PBMCP2RX7mRNA水平在企图自杀者和非企图自杀者中均显著下降。9个Affymetrix基因表达微阵列研究的综合分析表明，与非自杀对照相比，P2RX7mRNA水平在自杀案例的PFC中持续下降校正的P=O.03。[0189]在PTSD和MDD的企图自杀者和非企图自杀者的HAMD或HARS分数和P2RX7mRNA水平之间没有显著相关性。[0190]例5[0191]选择每只重150-200克的成年雄性SD大鼠。一些大鼠在它们的饲养笼中保持原状作为对照，而同等数量的大鼠暴露于不可逃避的尾巴冲击应激）。[0192]应激实验方案涉及将大鼠实验组放在有机玻璃约束管（23.4厘米长，直径7厘米）中，并将它们们暴露于100次不可逃避的电击2.0毫安），每次5秒，平均试验间隔60秒。冲击通过贴在尾巴上的电极施加。优化冲击的数量和强度，以产生通过行为变化和升高的血浆皮质酮水平测定的不可逃避的应力的模型。使用的动物的数量和它们的痛苦降到最低。总应激时间持续约1〇〇分钟。应激或终止后，所有的动物返回它们的饲养笼。[0193]通过不可逃避的尾巴冲击后立即或48h后短暂暴露于异氟醚麻醉所有大鼠。斩首后迅速取出它们的大脑。所有的解剖在放置于碎冰上的磨砂玻璃板上进行。大脑样品，如前额皮质、海马、扁桃体和小脑迅速在干冰上冷冻并储存在-70°C直至使用时。采集并冷动血液。[0194]无应激对照组或应激组的血浆皮质酮使用适当的酶免疫测定试剂盒，如DSL-10-81100ACTIVERatCorticosteroneDiagnosticSystemsLaboratories,Inc.,Webster,TX，USA进行测定。[0195]使用羊抗鼠IgG微孔板RDSysterns测定血浆P-11蛋白。为了制备板，首先，将100μ1的1:1000稀释的鼠抗人S100A10P-Il单克隆抗体Abcam，Ab52272转移到ELISA板的每个孔中。将板用膜密封，在室温下温育过夜。其次，1〇〇μ1的未知蛋白和标准品的稀释液加入到板中，在室温下孵育2小时。第三，100μ1的兔抗人P-11抗体（1:1000稀释）ProteintechGroup，Cat.#:11250-1-ΑΡ加入板中并在4°C下孵育过夜。第四，将100μ1链亲和素-HRP抗兔IgG，RDSystems，Cat:DY998在室温下温育20分钟。上述步骤之间，将板洗涤三次。第五，在每个孔加入1〇〇μ1底物溶液RDSystems，Cat.#:DY999，并在室温下孵育20分钟。第六，加入50μ1终止液，在30分钟内通过酶标仪测定每个孔的光密度OD。[0196]使用TRIzol从组织或血细胞裂解液中提取RNA。对每个样品通过使用SuperscriptIllRT逆转录_和寡聚dT引物从5微克总RNA产生cDNA，以排除RNA含量的差异可能也来自样品重量的差异的可能性。对生成的cDNA产物进行实时PCR。下面的序列使用用于人P-11mRNA分析：SEQIDNOs.l和2引物。使用用于大鼠的P-IlmRNA分析的序列是：正向5-TGCTCATGGAAAGGGAGTTC-SlSEQIDN0.7和反向5'-CCCCGCCACTAGTGATAGAA-31SEQIDNO.8引物。在对照和实验样品中，采用例3的SEQIDNOs.5和6,使用β-actinmRNA的水平作为内部参照，用于标准化P-IlmRNA水平。稀释曲线确认阈值循环数对模板RNA的浓度的线性依赖性。在对照和实验样品中P-IlmRNA的测量通过使用标准曲线方法获得。[0197]发现这里详述的在mRNA水平中的这些趋势与从对象采集的其它样品关联;其它样品包括全血、脑脊髓液CSF、血浆、血清、尿液和唾液。通过对用于测试mRNA水平的样品的等分试样采用ELISA法测量蛋白水平，也证实P-11蛋白和P2RX7蛋白水平具有如用于mRNA的上述详细描述的趋势。[0198]用于PTSD和对照组的大鼠数据与例1中人的数据相关，证实本实验方案作为用于人非自杀PTSD的动物模型。[0199]应当理解，虽然本发明已结合其详细说明进行了描述，前述描述旨在说明而不是限制本发明的由所附的权利要求的范围所限定的范围。其它方面、优点和改变落在以下权利要求的范围之内。[0200]尽管至少一个示例性具体实施例已经在前面的详细描述中给出，但应理解存在大量的变体。还应当理解，单个示例性的具体实施例或多个示例性的具体实施例仅仅是例子，并不旨在以任何方式限制所描述的具体实施例的范围、适用性、或构成。相反，前面的详细描述将提供本领域技术人员实施单个示例性的具体实施例或多个示例性的具体实施例的方便的指南。应当理解，在元件的功能和设置上可以进行各种变化，而不背离如所附的权利要求及其法律等同物设定的范围。[0201]在本说明书中提到的专利文献和出版物表明本发明所属领域的技术人员的水平。这些文献和出版物在这里通过参考并入至犹如每单份文献或出版物具体地及单独地在这里通过参考并入的相同的程度。

权利要求：1.一种泛素蛋白连接酶E3AUBE3A在制备用于确定创伤后应激障碍PTSD存在的试剂盒中的用途，包括：基于从对象中获得的生物样品中测量的UBE3A的量，确定怀疑患有PTSD的对象中PTSD的存在。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括：如果对象为男性，则测量生物样本中与PTSD相关的至少一种PTSD标志物的量，其中所述的至少一种PTSD标志物为泛素结合酶E2L3;FasTNFRSF6相关死亡结构域蛋白；蛋白激酶，AMP激活的，βΐ非催化亚基;激肽释放酶10;丝裂原活化蛋白激酶4;TAF6RNA聚合酶II，TATA框结合蛋白（TBP相关因子，80kDa;蛋白激酶C，a;DNA断裂因子，45kDa，α多肽;三角形四肽重复干扰素诱导蛋白4;纹蛋白，钙调素结合蛋白；磷酸肌醇-3-激酶，催化的，α多肽;月中瘤坏死因子受体超家族、成员6;核自身抗原精子蛋白（组蛋白结合的）；ras同源基因家族、成员A;NIMAneverinmitosisgenea相关激酶2;SWISNF相关的，矩阵相关的，染色质肌动蛋白依赖性调节子，亚家族a，成员2;芳香烃受体核转位蛋白；突触相关膜蛋白，91kDa同源物（小鼠）；G1向S期转换蛋白2;或整合素，α2⑶49B，VLA_2受体的α2亚基），或其组合物；以及基于在生物样本中测量的至少一个PTSD标记物的量来确定对象中PTSD的存在。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括：如果对象是女性，则测量生物样品中与PTSD相关的至少一种PTSD标记物的量，其中所述至少一种PTSD标记物是运动神经元存活蛋白结合蛋白ISIPl;桥粒斑菲素蛋白2;分泌蛋白SEC8;表皮生长因子受体通路底物8;二酰基甘油激酶，Θ11OkDa;中心体相关蛋白2;通用转录因子IIF，多肽2，30kDa;神经源素3;或ADP-核糖转移酶，或其组合；以及基于在生物样本中测量的至少一个PTSD标记物的量来确定对象中PTSD的存在。4.根据权利要求1〜3中任一项所述的用途，其特征在于，还包括：测量生物样品中的自杀标记物的量，其中自杀标记物为P-11或P2RX7;以及基于在生物样本中测量的自杀标记物的量确定对象是否是自杀的。5.根据权利要求1〜3中任一项所述的用途，其特征在于，所述的生物样品是全血、血浆、血清、脑脊液、尿液、唾液、汗液、前额皮质组织、海马组织、或同侧皮层组织。6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括：监测从对象连续收集的生物样品中UBE3A量的时间变化。7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括：监测从对象连续收集的生物样品中UBE3A的量的时间变化，其中所述的对象与治疗药物一起施用以治疗PTSD。8.—种用于使用泛素蛋白连接酶E3AUBE3A来确定创伤后应激障碍PTSD的存在的试剂盒，包括：用于保持从对象分离的生物样品的基质；与UBE3A特异性相互作用的试剂；用于所述的试剂和所述的样品或所述的样品的一部分反应以检测用于诊断对象中PTSD的UBE3A的存在或量的印刷说明书。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂是特异性地结合针对UBE3A的自身抗体的抗原。10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂是特异性结合UBE3A的抗体。11.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂与UBE3A的相互作用通过酶联免疫吸附测定ELISA测定。12.—种用于确定对象中创伤后应激障碍PTSD的存在的体外诊断装置，所述装置包括：用于保持从对象收集的生物样品的样品室；与所述样品室流体连通的检测模块，所述的检测模块含有与泛素蛋白连接酶E3AUBE3A特异性相互作用的试剂；电源;以及与所述电源和所述检测模块可操作通信的数据处理模块；其中所述检测模块分析所述生物样品以检测存在于所述生物样品中的UBE3A并且将在所述生物样品中检测到的UBE3A的存在电子通信至所述数据处理模块；其中所述数据处理模块具有涉及检测对象中的PTSD的输出，所述输出是所测量的UBE3A的量，PTSD的存在或不存在或PTSD的严重性。13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，还包括显示器，与数据处理模块电子通信并显示所述输出。14.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，还包括发射器，用于将所述输出通信至远程位置。15.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述输出是数字化的。16.—种用于在对象中检测PTSD的体外诊断装置，其特征在于，所述装置包括：用于保持来自对象的生物样品的手持的样品室；与所述样品室流体连通的检测模块，所述检测模块含有与泛素蛋白连接酶E3AUBE3A特异性相互作用的试剂；以及响应在生物样品中存在的至少一种测量的UBE3A而提供比色变化的染料。

百度查询： 促进军事医学的亨利·M·杰克逊基金会公司 班扬生物标记公司 检测和监测用于PTSD的诊断生物标志物以及区分自杀式与非自杀式障碍的方法和试剂盒