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申请/专利权人：河南师范大学

摘要：本发明公开了一类具有免疫活性的α‑GalCer磷酸酯类化合物及其合成方法，属于有机合成技术领域。本发明的技术方案要点为：具有免疫活性的α‑GalCer磷酸酯类化合物，其结构式为：本发明还具体公开了该具有免疫活性的α‑GalCer磷酸酯类化合物的合成方法。本发明的合成方法操作简便、反应条件温和且所用试剂均为工业常用试剂，适合工业化制备，经过初步的生物活性试验表明制得的目标产物均具有良好的免疫活性。

主权项：具有免疫活性的α‑GalCer磷酸酯类化合物，其特征在于其结构式为：其中R2为C7‑25饱和直链或支链烷基、CH23CHCH32、C2‑9饱和直链或支链苯烷基、CH27Php‑F、m＝7、8或9，n＝4或7。

全文数据：具有免疫活性的α-GaICer磷酸酯类化合物及其合成方法技术领域[0001]本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一类具有免疫活性的Ct-GalCer磷酸酯类化合物及其合成方法。背景技术[0002]随着对肿瘤免疫认识和T细胞识别机制的突破性研究进展，神经鞘糖脂在肿瘤、月中瘤转移的诊治和预防开辟一全新免疫治疗途径，其对人类潜在的重大性引发人们致力于其新的高活性异构体的合成和发现。1990年代初，Kirin制药的一个研究小组报道了他们从冲绳海绵AgeIasmauritianus的提取物中筛选出的亲脂性成分的研究结果。当它们在小鼠中进行活体测试时，发现了一类具有潜在抗肿瘤活性的物质，并将其命名为agelasphins。随后的初步结构优化工作发现了当时活性最好的一个类似物，命名为α-GalCerKRN70003-GalCer引起了科研人员的极大兴趣，在随后的十几年中作为免疫促进剂成为广受关注的“明星分子”。研究表明α-GalCer具有抗肿瘤及免疫激活作用，能通过激活NKT细胞参与多种自身免疫性疾病、肿瘤、动脉粥状硬化和感染性疾病的免疫调节中，它作为抗癌新药已进入I期临床研究阶段。[0003][0004]α-GalCer与⑶Id蛋白结合，被递承到免疫系统的重要组成部分NKT细胞表层，激活一种被称之为细胞因子的与细胞间通信相关的信息分子。和自然产生的细胞因子一样，ThlTh2细胞因子会引起一系列的免疫反应，比如激活其它免疫细胞B细胞、T细胞和巨噬细胞等，去消灭肿瘤和抗菌Thl或抵抗自身免疫疾病Th2W-GalCer在动物模型中显示了对肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病良好的治疗效果，已引起了研究者们越来越多的关注。尤其是近几年来对α-GalCer及其类似物的研究发现，其在头颈部肿瘤、急性病毒感染、肝损伤的治疗或诊断具有良好的临床应用前景，并作为潜在疫苗佐剂被广泛研究。因此，对α-GalCer衍生物的研究将有望获得相关疾病预防、诊断与治疗的临床药物。[0005]磷酸基广泛存在于生物体内，如核苷酸ATP、GTP等，且磷酸基团由于具有三角锥体结构、在生理Ph值可作为氢的受体和供体的双重性能及二价或三价螯合性能，使其与生物靶标显示出独特的结合作用，在药物化学中成为羧基极具吸引力的生物替代体。目前，对于在α-GalCer的酰胺部分替换为含磷酸酯的三氮唑的类似物尚未报道，鉴于含磷酸化合物能被许多生物体接受，同时磷酸酯类化合物具有多种生物学功能。我们将α-GalCer中的酰胺键替换为含磷酸的三氮唑，获得了一系列具有良好生物活性的α-GalCer磷酸酯类衍生物。[0006]多年来，经过药物化学家对α-GalCer的构效关系研究表明，半乳糖部分是α-GalCer及其类似物活性表达所必需的结构部分，且糖苷键需保持α构型才具良好的生物活性。目前合成出来的大量类似物都或多或少的在ThlTh2的平衡中起到作用，但是未能达到选择性释放细胞因子而影响其生物活性的表达。三氮唑与酰胺是生物等排体，磷酸是生命体重要的组成成分，本专利经过多组分click反应合成一系列磷酸酯取代的三氮唑类α-GalCer类似物，以期改善细胞因子的特异性释放，从而改善其抗肿瘤及免疫调剂活性，通过药物活性筛选，寻找活性更好的药物先导化合物。本专利申请得到了国家自然科学基金21702051、河南师范大学博士启动课题（qdl5108、河南师范大学青年科学基金2016QK10、河南省高等学校重点科研项目计划（17A350006及环境化学与生态毒理学国家重点实验室KF2016-01的资助与支持。发明内容[0007]本发明解决的技术问题是提供了一类具有免疫活性的α-GalCer磷酸酯类化合物及其合成方法，该方法经过多组分click反应合成一系列磷酸酯取代的三氮唑类a-GalCer类似物，并经过初步的生物活性试验表明该类似物具有良好的免疫活性。[0008]本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，具有免疫活性的α-GalCer磷酸酯类化合物，其特征在于其结构式为：[0009][0010]其中R为C7-25饱和直链或支链烷基、（CH23CHCH32、C2—9饱和直链或支链苯烷基、[0011]本发明所述的具有免疫活性的α-GalCer磷酸酯类化合物的合成方法，其特征在于具体步骤为：[0012]1植物鞘胺醇1与叠氮试剂在碱和硫酸铜的作用下反应得到中间体2,其中叠氮试剂为叠氮基三甲基硅烷TMSN3、三丁基锡叠氮TBSnA、三氟甲基叠氮TfN3、叠氮磷酸二苯酯DPPA或叠氮四甲基胍TMGA，碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠或碳酸氢钠；[0013]2中间体2在溶剂吡啶中与三苯基氯甲烷反应得到中间体3;[0014]3中间体3在溶剂吡啶中与苯甲酰氯反应得到中间体4;[0015]⑷中间体4在酸的作用下反应得到受体5,其中酸为HC1、三氟化硼乙醚溶液、对甲苯磺酸或乙酸；[0016]5受体5和供体6溶于有机溶剂并在催化剂的作用下反应得到偶联产物7,其中当X为CUBr或I时，催化剂为碳酸钾、碳酸银、碳酸铯、碳酸汞、高氯酸银或高氯酸汞，当X为OAc时，催化剂为二溴化汞、三氯化铁、四氯化钛、二氯化锡或四氯化锡，当X为Set或SPh时，反应条件为N-碘代丁二酰亚胺NIS和催化剂三氟甲磺酸、三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟甲磺酸三乙基硅酯或叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯，当X为OCNHCCl3时，催化剂为三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟甲磺酸三乙基硅酯或叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯，有机溶剂为二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃或甲苯，供体6中心基团为苄基Bn、对甲氧基苄基PMB、乙酰基Ac、苯甲酰基Bz或特戊酰基Piv中的一种或多种；[0017]⑹偶联产物7与炔类化合物和磷酸酯在铜盐催化剂和碱的作用下经多组分click反应得到中间体8，其中铜盐催化剂为CuI、CuCl、CuBr、CuS〇4、CuCO3或CuNO3，碱为三乙胺、四甲基乙二胺或二异丙基乙基胺；[0018]7中间体8脱保护得到目标产物具有免疫活性的α-GalCer磷酸酯类化合物9，其中脱酰基保护的条件为甲醇钠、碳酸钾或氢氧化钠，脱苄基保护的条件为氢气钯碳或氢气氢氧化钯；[0019]合成过程的具体反应方程式为：[0020][0021]本发明的合成方法操作简便、反应条件温和且所用试剂均为工业常用试剂，适合工业化制备，经过初步的生物活性试验表明制得的目标产物均具有良好的免疫活性。具体实施方式[0022]以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。[0023][0024]1、以下提供本发明的实例（以如上化合物为例）：[0025]化合物2的合成：[0026]室温下，将植物鞘胺醇1置于二氯甲烷溶液中，依次加入TfN3KSeqv、硫酸铜0.01eqv和碳酸钾3eqv，室温搅拌过夜，加入水淬灭，乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干，柱色谱分离得到化合物2,产率为98%。[0027]化合物3的合成：[0028]将化合物2Ieqv溶解于吡啶中，加入三苯基氯甲烷（1.8eqv，加热反应过夜，蒸干有机溶剂，柱色谱分离得到化合物3，产率为89%。[0029]化合物4的合成：[0030]将化合物3Ieqv溶解在吡啶中，加入苯甲酰氯2eqv，反应过夜，加入水淬灭，用乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，蒸干，柱色谱分离得到化合物4，产率为90%。化合物5的合成：[0031]将化合物4溶解到二氯甲烷中，加入三氟化硼乙醚溶液（Ieqv，反应5小时后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，用二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，盐水洗涤，干燥，蒸干，柱色谱分离得到化合物5,产率为90%。[0032]化合物7的合成：[0033]在氮气保护下，向烧瓶中加入化合物5和全乙酰半乳糖施密特试剂6,再加入二氯甲烷，于-l〇°C条件下搅拌反应10分钟，然后逐滴加入三氟甲磺酸三甲基硅酯，继续低温反应3小时，经洗涤、干燥后，柱层析分离得到化合物7，收率为78%。[0034]化合物8的合成：[0035]将化合物7溶解到乙腈中，加炔（Ieqv、磷酸酯（2eqv、三乙胺（2eqv和氯化亚铜0.Ieqv，于室温反应过夜，旋干，柱层析分离的化合物8,收率80%。[0036]α-GalCer类似物9的合成：[0037]将化合物8溶解到甲醇中，加甲醇钠溶液（lmo1L，Ieqv，反应过夜，加入酸性树月旨，搅拌〇.5小时，白色固体析出，甲醇清洗即得α-GalCer类似物9，产率为99%。核磁确认为目标产物，1HNMR400MHz，CD30DCDC13=51:S=4.63d，J=3.2Hz，lH，4.21-4.18m，2H,4.01-3.97m，2H,3.74-3.68m，2H,3.61-3.55m，4H,3.30-3.27m，lH，2.20tJ=7.6Hz，2H,1.67-1.55m，4H,1.31-1.26m，44H,0.87t，J=6.4Hz，6Hppm。[0038]下列结构的α-GalCer磷酸酯类衍生物均可由以上设计路线合成获得。[0039]2、已获得的部分化合物结构[0045][0046]3、部分化合物初步测定的活性数据分析[0047]本实验通过体内免疫活性测试对所合成的系列α-GalCer类似物进行免疫活性评估。对所合成的新型糖脂抗体采用酶联免疫吸附试验ELISA检测其体内活性，即检测B6小鼠腹腔注射糖脂后不同时间点的Thl型细胞因子IFN-γ，IL-2等和Th2型细胞因子（IL-4的分泌水平，评价其分泌选择性。初步的生物活性测试表明所有化合物均具有良好的免疫活性，其中化合物1-4、1-5、1-7、1-8、1-11、1-14、1-15、1-18的免疫活性效果较好。[0048]以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

权利要求：1.具有免疫活性的α-GalCer磷酸酯类化合物，其特征在于其结构式为：其中R2为C7-25饱和直链或支链烷基、（CH23CHCH32、C2-9饱和直链或支链苯烷基、（CH22.—种权利要求1所述的具有免疫活性的α-GalCer磷酸酯类化合物的合成方法，其特征在于具体步骤为：1植物鞘胺醇1与叠氮试剂在碱和硫酸铜的作用下反应得到中间体2,其中叠氮试剂为叠氮基三甲基硅烷、三丁基锡叠氮、三氟甲基叠氮、叠氮磷酸二苯酯或叠氮四甲基胍，碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠或碳酸氢钠；⑵中间体2在溶剂吡啶中与三苯基氯甲烷反应得到中间体3;⑶中间体3在溶剂吡啶中与苯甲酰氯反应得到中间体4;⑷中间体4在酸的作用下反应得到受体5,其中酸为HC1、三氟化硼乙醚溶液、对甲苯磺酸或乙酸；5受体5和供体6溶于有机溶剂并在催化剂的作用下反应得到偶联产物7,其中当X为Cl、Br或I时，催化剂为碳酸钾、碳酸银、碳酸铯、碳酸汞、高氯酸银或高氯酸汞，当X为OAc时，催化剂为二溴化汞、三氯化铁、四氯化钛、二氯化锡或四氯化锡，当X为Set或SPh时，反应条件为N-碘代丁二酰亚胺和催化剂三氟甲磺酸、三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅脂、三氟甲磺酸三乙基硅脂或叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯，当X为OCNHCCl3时，催化剂为三氟化硼乙醚、三氟甲磺酸三甲基硅脂、三氟甲磺酸三乙基硅脂或叔丁基二甲硅基三氟甲磺酸酯，有机溶剂为二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃或甲苯，供体6中心基团为苄基、对甲氧基苄基、乙酰基、苯甲酰基或特戊酰基中的一种或多种；6偶联产物7与炔类化合物和磷酸酯在铜盐催化剂和碱的作用下经多组分click反应得到中间体8，其中铜盐催化剂为CuI、CuCI、CuBr、CuS〇4、CuCO3或CuNO3，碱为三乙胺、四甲基乙二胺或二异丙基乙基胺；7中间体8脱保护得到目标产物具有免疫活性的α-GalCer磷酸酯类化合物9,其中脱酰基保护的条件为甲醇钠、碳酸钾或氢氧化钠，脱苄基保护的条件为氢气钯碳或氢气氢氧化钯；合成过程的具体反应方程式为：

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