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申请/专利权人：山东大学

摘要：本发明公开了一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim‑3抗体和α‑galcer的组合及应用。本发明研究团队发现，HBV感染患者CD8+T、NK、iNKT和单核巨噬细胞表面Tim‑3均呈现不同程度升高，Tim‑3高表达与HBV患者肝固有免疫、适应性免疫耐受密切相关，除α‑Galcer外，Tim‑3在阻碍HBV清除过程中发挥关键作用，在α‑Galcer活化iNKT的同时，干预免疫细胞检查点Tim‑3，能逆转HBV肝免疫耐受，实现HBV转归。本发明采用抗Tim‑3抗体联合应用α‑Galcer可有效清除HBV，显著降低HBV病毒载量及血清HBsAg及肝组织pgRNA水平。

主权项：1.一种药物组合物在制备降低HbsAg药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括抗Tim-3抗体和α-Galcer；抗Tim-3抗体和α-Galcer的质量比为50:1。

全文数据：一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim-3抗体和α-galcer的组合及应用技术领域本发明涉及乙型肝炎生物治疗研究领域，尤其涉及一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim-3抗体和α-galcer的组合以及α-galcer联合抗Tim-3抗体免疫疗法在清除乙型肝炎病毒中的作用。背景技术乙型肝炎病毒HepatitisBvirus，HBV为嗜肝DNA病毒，HBV感染可诱发肝脏炎症反应，造成肝细胞损伤。HBV持续感染可诱发肝纤维化，甚至肝细胞肝癌hepatocellularcarcinoma，HCC，是危害人类身体健康的重要危险因素。HBV慢性感染与HBV诱导机体发生肝免疫耐受有关。慢性感染患者的肝固有免疫细胞，肝适应性免疫细胞均处在对HBV低应答、甚至无应答状态，这使HBV产生免疫逃逸并在肝细胞内持续扩增。现有HBV临床治疗方案多倾向于药物抗病毒疗法，但药物治疗只能抑制病毒复制，并不能彻底清除肝细胞内HBV，且长时间药物治疗易对机体产生一定毒副作用并导致HBV耐药株的出现。而通过干预免疫检查点并结合其他免疫调节增强剂的联合治疗将有助于逆转肝免疫耐受、恢复机体自身免疫细胞功能、增强免疫细胞活性，在阻断HBV慢性感染中展现了良好的应用前景。慢性HBV感染的形成机制非常复杂，关于细胞免疫的调控机制原理也一直是学者们的研究热点。iNKTinvariantnaturekillerT细胞，又称经典型或恒定NKT细胞，同时表达NK细胞表面标志以及恒定的Vαl4-Jα18链TCR。iNKT细胞，识别由CD1d提呈的脂类抗原分子，可被α-半乳糖酰基鞘氨醇α-GalCer特异性激活。被活化的iNKT细胞产生多种细胞因子，尤其是IL-4和IFN-γ，参与多种途径的免疫调节。iNKT细胞可以被CD1d-β2m复合物第一信号激活，第二信号既可通过CD28、ICOS等通路传递正向活化信号，也可通过CTLA-4、PD-1、Tim-3等通路传递负向抑制信号。作为联系机体固有免疫、适应性免疫的桥梁，iNKTInvariantnaturalkillerT细胞在肝免疫过程中发挥重要作用。活化iNKT细胞可增强肝固有免疫、适应性免疫应答。α-Galcer可有效活化iNKT细胞，但临床研究证实，常用α-Galcer治疗剂量可有效活化iNKT细胞并降低HBVDNA病毒载量，但毒性作用太大。而降低α-Galcer剂量虽可降低度副作用，但活化iNKT和抑制HBV复制的作用却大大降低，治疗效果很不理想。Tim-3Tcellimmunoglobulin-andmucin-domain-containingmolecule-3是关键的免疫负调控分子，与其配体galectin-9相互作用可负向调控IFN-γ的产生，在诱导机体免疫耐受中发挥重要作用。Tim-3最初发现其主要表达于Th1细胞中，但最近研究显示Tim-3在CD8+T、DC、NK、NKT和单核巨噬细胞等多种免疫细胞上均有表达，并通过影响这些细胞的功能，参与多种疾病的发生发展。靶向Tim-3的免疫疗法已在多种肿瘤中展现了很好的治疗作用，但目前靶向Tim-3对于逆转HBV慢性感染的作用和机制尚不清楚。发明内容基于现有HBV清除方法的缺乏与不足，本发明阐明抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer清除HBV的可行性，为HBV转归临床治疗提供理论依据和治疗方案。具体的，本发明公开了以下技术方案：首先，本发明通过实验证实，HBV感染患者CD8+T、NK、iNKT和单核巨噬细胞表面Tim-3表达均呈现不同程度升高，Tim-3高表达与HBV患者肝固有免疫、适应性免疫耐受密切相关。基于这一发现，本发明提供一种iNKT细胞表面Tim-3表达水平检测的诊断试剂，所述诊断试剂用于检测iNKT细胞表面Tim-3的表达水平。在具体实施方案中，所述诊断试剂用于检测iNKT细胞表面Tim-3的蛋白表达水平，例如可以借助流式细胞仪检测iNKT细胞表面Tim-3蛋白表达水平。更为优选的实施方案中，所述诊断试剂包含抗Tim-3的抗体，例如WO2016161270A1公开了一系列抗Tim-3的抗体，在此一并纳入本发明。其次，本发明发现除α-Galcer外，某些免疫检查点负性调控因素Tim-3在阻碍HBV清除过程中发挥关键作用，在α-Galcer活化iNKT的同时，干预免疫细胞检查点Tim-3，有可能逆转HBV肝免疫耐受，实现HBV转归，并且通过进一步的实验结果确认，抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer可有效清除HBV，显著降低HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平。本发明涉及的联合生物治疗方案，将为HBV联合治疗提供理论依据。基于这一发现，本发明提供一种用于HBV慢性感染治疗的药物组合物，该组合物包括抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物。抗Tim-3抗体包括但不限于现有技术公开的针对Tim-3的抗体，例如WO2016161270A1公开了一系列抗Tim-3的抗体，在此一并引入本发明。α-半乳糖酰基鞘氨醇α-Galcer是一种从海绵体中提取有CD1d递呈的糖酯，由亲水性的碳酸化合物部分与疏水性的酰基鞘氨醇部分通过α连接形成，α-Galcer是NKT细胞的配体，在体内外均能有效激活NKT细胞。α-Galcer功能衍生物，是指α-Galcer的衍生物或其改性糖酯，其作用机制同α-Galcer，能有效激活NKT细胞。例如CN105339379A公开了改性的糖酯及其制备方法，在此一并纳入本发明。优选的实施方案中，抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的质量比为30-80：1，例如，50:1。所述抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的用量比可相应调剂，使其既可以发挥阻断Tim-3的作用又可以发挥α-Galcer效果、有效激活NKT细胞，从而显著降低HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平。本发明所述的药物组合物除包括抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物外，还可以包括常规药学上可接受的载体或赋形剂等，以满足制剂过程中的需要。此外，本发明还公开了抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物在制备HBV慢性感染治疗的药物中的用途。具体的实施方案中，所述药物抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物可有效清除HBV、显著降低HBV病毒载量、降低HBsAg量、降低肝组织pgRNA水平。为增强肝免疫细胞功能，强化其清除HBV病毒作用，本发明重点从以下几个方面进行研究并取得了相应有益效果：1本发明通过实验确认了Tim-3在HBV感染肝iNKT细胞高表达的结果；通过检测iNKT细胞表面Tim-3的表达水平可以辅助用于HBV慢性感染的诊断。2本发明研究发现体内注射抗Tim-3抗体，对iNKT细胞具有活化作用，并且活化的iNKT细胞通过分泌细胞因子增强NK、CD8+T细胞功能；为HBV联合治疗提供理论依据。3本发明通过实验证实抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer可有效清除HBV，显著降低HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平，克服了单纯应用α-Galcer活化iNKT细胞不能有效降低HBVDNA病毒载量的问题。附图说明图1流式检测iNKT细胞表面Tim-3的表达结果：图1A为流式检测CD3+CD1d+iNKT细胞图，图1B为细胞表面Tim-3分子表达情况，图1C为Tim-3在HBV-Tg小鼠和对照小鼠之间的差异表达情况。图2阻断Tim-3促进α-Galcer诱导的iNKT细胞活化实验结果：图2A为流式检测α-Galcer+aTim-3组IFN-γ，图2B为α-Galcer+aTim-3组IFN-γ检测结果，图2C为流式检测α-Galcer+aTim-3组CD107a，图2D为α-Galcer+aTim-3组CD107a检测结果。图3α-Galcer联合抗Tim-3中和抗体结果：图3A为NK细胞流式结果，图3B为CD8+T细胞流式结果。图4α-Galcer及联合抗Tim-3中和抗体方案对HBV复制的影响结果：图4A为抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer降低血清HbsAg，图4B为抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer降低血清HBV-DNA，图4C、图4D为抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer降低肝组织pgRNA水平。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和或它们的组合。正如背景技术所介绍的，现有技术中虽然α-Galcer可有效活化iNKT细胞，并被应用于HBV临床治疗，但单纯应用α-Galcer活化iNKT细胞，并不能有效降低HBVDNA病毒载量，为了解决如上技术问题，本发明发明人展开研究，通过实验证实，HBV感染患者CD8+T,NK，iNKT，单核巨噬细胞表面Tim-3均呈现不同程度升高，Tim-3高表达与HBV患者肝固有免疫、适应性免疫耐受密切相关。本发明发现除α-Galcer外，免疫检查点负性调控因素Tim-3在阻碍HBV清除过程中发挥关键作用，在α-Galcer活化iNKT的同时，干预免疫细胞检查点Tim-3，有可能逆转HBV肝免疫耐受，实现HBV转归，并且通过进一步的实验结果确认，抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer可有效清除HBV，显著降低血清HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平。在具体的实施方案中，本发明提供一种用于HBV慢性感染治疗的药物组合物，该组合物包括抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物。抗Tim-3抗体包括但不限于现有技术公开的针对Tim-3的抗体，例如WO2016161270A1公开了一系列抗Tim-3的抗体，在此一并引入本发明。α-半乳糖酰基鞘氨醇α-Galcer是一种从海绵体中提取有CD1d递呈的糖酯，由亲水性的碳酸化合物部分与疏水性的酰基鞘氨醇部分通过α连接形成，α-Galcer是NKT细胞的配体，在体内外均能有效激活NKT细胞。α-Galcer功能衍生物，是指α-Galcer的衍生物或其改性糖酯，其作用机制同α-Galcer，能有效激活NKT细胞。例如CN105339379A公开了改性的糖酯及其制备方法，在此一并纳入本发明。优选的实施方案中，抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的质量比为30-80：1，例如，50:1。所述抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的用量比可相应调剂，使其既可以发挥阻断Tim-3的作用又可以发挥α-Galcer效果、有效激活NKT细胞，从而显著降低HBV病毒载量及HBsAg及肝组织pgRNA水平。本发明所述的药物组合物除包括抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物外，还可以包括常规药学上可接受的载体或赋形剂等，以满足制剂过程中的需要。在具体的实施方案中，本发明公开了抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物在制备HBV慢性感染治疗的药物中的用途。具体的实施方案中，所述药物抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物可有效清除HBV、显著降低HBV病毒载量、降低HBsAg量、降低肝组织pgRNA水平。在进一步的实施方案中，本发明公开了HBV慢性感染治疗的联合治疗方法，包括采用抗Tim-3抗体和α-Galcer或其功能衍生物的联合治疗方案。通过该方案，实现HBV转归。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。实施例1流式检测HBV-Tg小鼠肝iNKT细胞表面Tim-3表达1.处死小鼠，消毒皮肤，打开腹腔，取出肝脏，PBS保持其湿润。2.在研钵中将肝脏剪碎，研磨，200目铜网过滤，15ml或50ml离心管收集细胞滤液。3.400rpm，离心1min，收集上清。4.1500rpm，离心8min，弃掉上清。5.红细胞裂解液5ml重悬细胞沉淀，混匀，4度孵育5min，再以1500rpm离心8min，弃上清。期间配置40％percoll溶液。6.离心完毕加入8ml40％percoll溶液，重悬、混匀细胞，水平转子离心25min，转速为2500rpm。7.离心完毕，溶液分三层，吸弃上面两层，保留底层细胞沉淀。8.5mlPBS重悬、混匀细胞，1500rpm离心8min，弃上清，再加1mlPBS重悬细胞。计数，调整细胞浓度到1*106～1*107ml。9.取100μl细胞悬液到流式管，加入CD1dtetramerPBS-57,美国国立卫生院NIH赠送或其对照unloaded，NIH赠送10μl，4℃孵育30min，再加入anti-CD3e克隆号145-2C11，eBioscience和抗Tim-3抗体克隆号RMT3-23，eBioscience，继续孵育30min。10.孵育结束，加入2mlPBS洗细胞，1500rpm离心6min，弃上清，再加入2mlPBS洗细胞一次，方法同前。11.取1％的多聚甲醛PBS液500μl重悬、混匀细胞沉淀，准备上机检测。结果如图1所示，圈出CD3+CD1d+iNKT细胞图1A，分析其表面Tim-3分子表达图1B，并统计比较Tim-3表达在HBV-Tg小鼠和对照小鼠之间的差异图1C，HBV-Tg鼠iNKT细胞表面Tim-3表达显著升高。实施例2α-Galcer预处理，流式细胞仪检测iNKT细胞IFN-γ和CD107a的分泌1.选取6-8周龄HBV-Tg小鼠，尾静脉注入2μgα-Galcer溶液，注入总体积为200μl，注射完毕观察小鼠状态无异常。2.24小时后处死小鼠，分离肝单个核细胞，分离的细胞用1640培养基洗一遍。3.用1640+10％FBS培养基重悬细胞，种24孔板，种板密度为1*106孔。4.加入布雷菌素BFA,1μgml阻断蛋白分泌，并同时加入anti-CD107a克隆号1D4B，Biolegend用来检测CD107a。5.2小时后收细胞，2mlPBS洗细胞两次，转速为1500rpm，离心6min，弃上清，100μlPBS重悬细胞。6.加入CD1dtetramer或其对照10μl，4度孵育30min，再加入anti-CD3继续孵育30min。孵育结束，加入2mlPBS洗细胞，1500rpm离心6min，弃上清。7.然后：①加了anti-CD107a的孔，继续加2mlPBS洗细胞，方法同前。1％的多聚甲醛PBS液500μl重悬细胞，待用；②用100μlFixationbuffereBioscience重悬细胞，4℃固定30min，再加2mlPermealizationbuffereBioscience洗细胞，1500rpm离心8min，弃上清，100μlPermealizationbuffer重悬细胞，加入anti-IFN-γ，4℃孵育30min。8.孵育结束，加2mlPBS洗细胞两次，转速为1500rpm，离心8min，弃上清，1％的多聚甲醛PBS液500ul重悬细胞，待用。实施例3α-Galcer预处理，流式细胞仪检测CD8+T细胞和NK细胞IFN-γ和CD107a表达1.小鼠处理、肝单个核细胞分离及细胞的培养、刺激等方法同实施例2中关于IFN-γ的描述一致。2.洗细胞后，100ulPBS重悬细胞，加入anti-CD3e克隆号145-2C11，eBioscience，anti-CD8a克隆号53-6.7，eBioscience，anti-NK1.1克隆号PK136，eBioscience和anti-CD49b克隆号为DX5，BDPharmingen，4℃孵育30min。3.再加入2mlPBS洗细胞，1500rpm离心8min，其后标记或检测IFN-γ或CD107a的步骤如2中所述。其中：CD3+CD8+细胞定义为CD8T细胞，CD3-NK1.1Dx5+细胞为NK细胞。结果如图2所示，验证抗Tim-3抗体联合α-Galcer对iNKT细胞功能的影响，本发明用100μg抗Tim-3中和抗体或对照IgG预处理小鼠并检测iNKT细胞功能。流式结果表明，α-Galcer+aTim-3组IFN-γ图2A,B和CD107a图2C,D的表达要显著高于单独α-Galcer+IgG组及其他各组。实施例4α-Galcer联合抗Tim-3中和抗体方案1选取6-8周龄HBV-Tg小鼠，腹腔注射100μg抗Tim-3中和抗体或其对照IgG。2.24小时后尾静脉注入2ugα-Galcer或0.5％DMSO的NaCl对照溶液，注射总体积为200ul。3.48小时处死小鼠，分离肝单个核细胞。4.流式细胞仪检测iNKT细胞、CD8T细胞及NK细胞IFN-γ和CD107a的表达，方法同前所述。结果如图3所示，抗Tim-3抗体联合α-Galcer对NK和CD8+T细胞具有活化作用，流式结果表明，α-Galcer增加NK细胞比例，以及胞内IFN-γ和CD107a水平图3A，与此同时，CD8+T细胞比例及IFN-γ和CD107a水平也显著增强图3B。实施例5检测α-Galcer及联合抗Tim-3中和抗体方案对HBV复制的影响观察HBV复制的指标主要检测三个：表面抗原HBsAg、乙肝病毒的脱氧核糖核酸HBVDNA及HBV前基因组RNApgRNA。方法如下：1建模小鼠摘眼球取血，于1.5mlEP管中离心，转速设置为4000rpm，20min后小心吸取上清：①双抗体夹心法酶联免疫吸附试验ELISA检测血清中HBsAg的含量。②荧光定量PCRQiagen检测血清中HBVDNA的含量。2另外，剪取豆粒大小肝组织，研碎。3适量肝组织TRIZOL法提取RNA，再逆转录为DNATIANGEN，天根逆转录试剂盒。荧光定量PCR和普通PCR检测肝组织pgRNA的含量。引物：上游引物：CTCAATCTCGGGAATCTCAATGTSEQIDNO:1，下游引物：AGGATAGAACCTAGCAGGCATAATSEQIDNO:2，产物大小231bp。结果如图4所示，抗Tim-3抗体联合应用α-Galcer显著降低HBV-Tg小鼠血清HbsAg、HBV-DNA及肝组织pgRNA水平。α-Galcer显著降低HBV-Tg小鼠血清HbsAg水平，阻断Tim-3明显增强α-Galcer诱导的HbsAg清除图4A。同样，与单独α-Galcer刺激组相比较，抗Tim-3抗体联合α-Galcer对血清HBV-DNA降低作用更加显著4B。抗Tim-3抗体联合α-Galcer可显著降低HBs-TgC57B6小鼠肝组织pgRNA表达图4C,4D。SEQUENCELISTING山东大学一种逆转乙型肝炎病毒慢性感染的抗Tim-3抗体和α-galcer的组合及应用2PatentInversion3.5123DNA人工1ctcaatctcgggaatctcaatgt23224DNA人工2aggatagaacctagcaggcataat24

权利要求：1.一种药物组合物在制备降低HbsAg药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括抗Tim-3抗体和α-Galcer；抗Tim-3抗体和α-Galcer的质量比为50:1。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物除包括Tim-3抗体和α-Galcer外，还可以包括常规药学上可接受的载体和赋形剂。

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