买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：中国科学院微生物研究所;安徽大学

摘要：本发明公开了一种双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用。本发明提供了一种双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体构建方法，利用该方法成功构建了用于敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇的双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体。通过实验证明：本发明构建的用于敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇的双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体可成功敲除海洋疣孢菌abyssomicin基因簇。

主权项：一种CRISPR‑Cas9载体，其包括双spacer的sgRNA表达盒和CAS9蛋白表达盒；所述双spacer的sgRNA表达盒表达名称为sgRNA1和名称为sgRNA2的两个sgRNA；所述CAS9蛋白表达盒表达CAS9蛋白；所述双spacer的sgRNA表达盒由名称分别为sgRNA1的表达盒和sgRNA2的表达盒连接而成；所述sgRNA1的表达盒和所述sgRNA2的表达盒的转录方向相反。

全文数据：一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用技术领域[0001]本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种双spacer序列识别切割CRISPR一Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用。背景技术[0002]疣孢菌属Verrucosispora属于小单孢菌目小单孢菌科Micromonosporaceae,是一类重要的“稀有放线菌”，其产生很多的活性次级代谢产物，如抗肿瘤细胞系活性的proximicins和抗结核分枝杆菌的abyssomicins等，这些化合物具有很好的成药潜力。然而海洋疣孢菌传统的基因敲除策略基本上是通过同源重组方式来实现的，整个过程周期长，工作量大，效率低且很难进行无痕敲除。抗性标记也会为之后对菌株的操作造成影响。[0003]基于CRISPRClusteredRegularlyInterspacedSmallPalindrotnicRepeatsCas9系统的基因组编辑方法己经彻底改变了人类编辑基因组的历史。CRISPRCas9系统是原核生物中广泛存在的一套针对外源核酸分子入侵的适应性免疫系统，可以抵御噬菌体侵染，消灭偶然转化获得的质粒等。当细胞第一次被攻击后，入侵的DNA的部分序列有规律的整合到事先存在的CRISPR重复序列之间，称为间隔子spacer。当细胞再次受到攻击时，这段序列被一同转录为小分子RNA-crRNACRISPRRNA。对于CRISPRII型系统，还存在一个小分子RNA-tracrRNA与crRNA形成二聚体，一同被加工、行使功能。与其他类型相比，CRISPRII型系统的结构是最紧凑的:唯一的蛋白酶CAS9在crRNA:tracrRNA双元分子的指导下入侵的DNA双链中形成R-l00p。蛋白酶CAS9的两个内切酶活位点对DNA进行序列特异的切割。为了正确的识别外源DNA分子，spacer序列下游（5’-3’方向）存在PAMProtospacerAdjacentMotif基序5’-NGG-3’。为了便于载体构建，crRNA:tracrRNA双元分子可以融合为单个的sgRNAsingleguideRNA，其5’端20nt是负责识别特定基因的区域。这样只要同时表达CAS9蛋白和sgRNA就有可能实现基因组编辑。这种基于CRISPRCas9系统的技术不同于以往基于蛋白质的基因组编辑技术，CRISPRCas9系统对DNA进行特异的切割是由小分子RNA介导的，针对不同的靶标基因，只需要设计、替换不同的小分子RNA即可。[0004]目前，己发表在放线菌中使用一个spacer序列识别并切割基因组的CRISPRCas9系统脱靶概率高，且通过同源重组修复后，部分基因由于重组到质粒上导致其功能不变，只能先进行质粒丢失工作再进行下一步工作。切割之后，放线菌有一定几率自身修复，也会导致基因无法删除。同时，已知双spacer—般进行基因全合成方式克隆，成本昂贵且时间较长，同时其使用同一种启动子和终止子，增加了质粒的不稳定性。故亟需开发一种构建成本低、稳定的双spacer序列识别切割放线菌基因组CRISPR_Cas9系统，提高基因组编辑效率。发明内容[0005]本发明的一个目的是提供一种CRISPR-Cas9载体。[0006]本发明提供的CRISPR-Cas9载体包括双spacer的sgRNA表达盒和CAS9蛋白表达盒；[0007]所述双spacer的SgRNA表达盒表达名称为sgRNAl和名称为sgRNA2的两个SgRNA;[0008]所述CAS9蛋白表达盒表达CAS9蛋白；[0009]所述双spacer的sgRNA表达盒由名称分别为sgRNAl的表达盒和sgRNA2的表达盒连接而成；[0010]所述sgRNAl的表达盒和所述sgRNA2的表达盒的转录方向相反。[0011]上述CRISPR-Cas9载体中，所述sgRNAl的表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子甲的启动子、sgRNA1的编码基因和名称为终止子甲的终止子;所述启动子甲启动所述sgRNAl的编码基因的表达；[0012]所述sgRNA2的表达盒自上游至下游依次包括名称为终止子乙的终止子、SgRNA2的编码基因和名称为启动子乙的终止子;所述启动子乙启动所述sgRNA2的编码基因的表达；[0013]所述CAS9蛋白表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子丙的启动子、CAS9蛋白的编码基因和名称为终止子丙的终止子;所述启动子丙启动CAS9蛋白的表达；[0014]所述启动子甲和所述启动子乙为不同或相同的启动子；[0015]所述终止子甲和所述终止子乙为不同或相同的终止子。[0016]上述CRISPR-Cas9载体中，[0017]所述启动子甲具体为启动子ermE;所述启动子乙具体为启动子psf;所述启动子丙具体为启动子tipA;所述终止子甲具体为终止子Tem21;所述终止子乙具体为终止子to;所述终止子丙具体为终止子fd。[0018]上述CRISPR-Cas9载体中，[0019]所述CRISPR-Cas9载体还包括靶基因的同源臂序列；[0020]所述靶基因的同源臂序列位于所述CAS9蛋白表达盒的下游。[0021]上述CRISPR-Cas9载体中，[0022]所述耙基因为abyssomicin基因簇；[0023]所述sgRNAl的编码基因序列为序列3第3120-3139位；[0024]所述sgRNA2的编码基因序列为序列3第3649-3668位；[0025]所述CAS9蛋白的编码基因序列为序列3第3933-8039位；[0026]所述同源臂序列由同源左臂序列和同源右臂序列组成；[0027]所述同源左臂序列为序列3第9219-11039位；[0028]所述同源右臂序列为序列3第11040-12908位。[0029]上述CRISPR-Cas9载体中，所述CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列为序列3。[0030]本发明的另一个目的是提供上述CRISPR-Cas9载体的新用途。[0031]本发明提供了上述CRISPR-Cas9载体在敲除靶基因中的应用。[0032]本发明还提供了上述CRISPR-Cas9载体在敲除放线菌靶基因中的应用。[0033]上述应用中，所述放线菌为海洋疣孢菌;所述海洋疣孢菌为海洋疣孢菌MS100047。[0034]本发明还有一个目的是提供上述CRISPR_Cas9载体的构建方法。[0035]本发明提供的RISPR_Cas9载体的构建方法包括如下步骤：[0036]1制备辅助克隆spacer的载体pHelp[0037]所述辅助克隆spacer的载体pHelp包括名称为表达盒甲的表达盒，所述表达盒甲自上游至下游依次包括上述启动子甲、ncRNAl编码基因和上述终止子甲，所述ncRNAl编码基因含有限制性内切酶A的识别序列和限制性内切酶B的识别序列；[0038]⑵制备转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9[0039]所述转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9包括名称为表达盒乙的表达盒和上述CAS9蛋白表达盒，所述表达盒乙自上游至下游依次包括上述启动子乙、ncRNA2编码基因、上述终止子乙、限制性内切酶C的识别序列、抗性基因和限制性内切酶D的识别序列;所述ncRNA2编码基因含有限制性内切酶A的识别序列和限制性内切酶B的识别序列；[0040]3制备带有限制性内切酶A的粘性末端、靶基因spacer序列1和限制性内切酶B的粘性末端的双链DNA分子甲；[0041]制备带有限制性内切酶C的粘性末端、靶基因spacer序列2和限制性内切酶D的粘性末端的双链DNA分子乙；[0042]⑷将所述双链DNA分子甲通过酶切连接替换所述辅助克隆spacer的载体pHelp中所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp，其含有上述sgRNAl的表达盒；[0043]将所述双链DNA分子乙通过酶切连接替换所述转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9中所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9，其含有上述sgRNA2的表达盒；[0044]⑸将所述含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp中所述sgRNAl的表达盒替换所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9中所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D之间的片段，得到CRISPR-Cas9载体。[0045]上述方法中，[0046]所述步骤⑷和步骤⑸之间还包括将靶基因的同源臂序列插入所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9中的步骤；[0047]上述方法中，所述步骤⑷包括如下步骤：[0048]用限制性内切酶A和限制性内切酶B酶切所述辅助克隆spacer的载体pHelp，得到带有限制性内切酶A的粘性末端和限制性内切酶B的粘性末端的载体骨架A;再将所述双链DNA分子甲与所述载体骨架A连接；[0049]用限制性内切酶A和限制性内切酶B酶切所述转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9,得到带有限制性内切酶A的粘性末端和限制性内切酶B的粘性末端的载体骨架B;再将所述双链DNA分子乙与所述载体骨架B连接；[0050]上述方法中，所述限制性内切酶A具体为Ncol;所述限制性内切酶B具体为Xbal;所述限制性内切酶C具体为Spel;所述限制性内切酶D具体为Nhel。[0051]上述方法中，所述靶基因spacer序列1为序列4;所述靶基因spacer序列2为序列5。[0052]本发明还有一个目的是提供上述辅助克隆spacer的载体pHelp和或上述转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9。[0053]上述辅助克隆spacer的载体pHelp和或上述转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9在敲除靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。[0054]上述辅助克隆spacer的载体pHelp和或上述转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9在敲除放线菌靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。[0055]本发明的最后一个目的是提供一种用于敲除靶基因的成套产品。[0056]本发明提供的成套产品包括上述辅助克隆spacer的载体pHelp和或上述转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9。[0057]上述成套产品在敲除靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。[0058]上述成套产品在敲除放线菌靶基因中的应用也属于本发明的保护范围。[0059]本发明的有益效果在于：[0060]1•本发明提供的双spacer技术相比现有的直接全合成两个SgRNA以及其启动子和终止子的策略有成本上的优势。[0061]2.本发明提供的双spacer技术选用不同的启动子和终止子，并且其在载体上反向排列，增加了质粒的稳定性。[0062]3•本发明提供的双spacer基因删除技术可以在海洋疣孢菌中删除掉约61kb的长片段基因。[0063]4•海洋疣孢菌中次级代谢产物基因簇丰富，通过本研究对abyssomicin基因簇进行敲除工作，可以更好地对其他基因簇进行研宄，检测其他次级代谢产物的产生。[0064]本发明提供了一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建方法，利用该方法成功构建了用于敲除海洋抚孢菌abyssomicin基因簇的双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体。通过实验证明：本发明构建的用于敲除海洋疵抱菌abyssomicin基因族的双spacer序列识别切割CRISPR_Cas9载体可成功敲除海洋抚抱菌abyssomicin基因族。附图说明[0065]图1为pHelp质粒载体图谱。[0066]图2为改造的pCRISPR-Cas9质粒载体图谱。[0067]图3为aby基因簇敲除PCR验证图。第一个泳道为marker，第二个泳道为野生型菌株左臂PCR结果，第三个泳道为突变菌株左臂PCR结果，第四个泳道为野生型菌株右臂PCR结果，第五个泳道为突变菌株右臂PCR结果。[0068]图4为aby基因簇敲除发酵结果HPLC图。具体实施方式[0069]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0070]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0071]下面结合附图对本发明作进一步说明：[0072]下述实施例中的海洋疣孢菌MS100047记载于如下文献:Anti-MRSAandanti-TBmetabolitesfrommarine-derivedVerrucosisporasp.MS100047,ApplMicrobiolBiotechnol2016100:7437-7447,公众可从中科院微生物所获得。[0073]下述实施例中的VerOl培养基的配方如下：可溶性淀粉1〇g，葡萄糖1〇g，甘油1〇g，玉米粉2_5g，蛋白胨Difco5g，酵母提取物0X0ID2g，氯化钠lg，使用1L蒸馈水充分溶解，调节pH到7•5，再加入3g碳酸|丐。固体VerOl培养基再加入2〇g琼脂。[0074]下述实施例中的高天培养基的配方如下:可溶性淀粉20g，L—天冬素5g，氯化钠5g，MgS〇4.7H2〇5g，KN〇3lg’fcHPCk.lfcO5g，使用让蒸馈水充分溶解，调节pH到7.5,加入“碳酸钙。高天固体培养基再加入20g琼脂。[0075]下述实施例中的E.coliET12567pUZ8002感受态细胞由英国Johninners研究所免费提供科学界使用，参考〈practicalstreptomycesgenetics〉，记载于如下文献:AnewsalicylatesynthaseAmSisidentifiedforsiderophoresbiosynthesisinAmycolatopsismethanolica239,公众可从中科院微生物所获得。[0076]实施例1、一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体的构建及其在疣孢菌中的应用[0077]一、双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体的构建[0078]1、改造辅助克隆spacer的载体pHelp[0079]改造辅助克隆转录sgRNA的载体pHelp通过包括如下步骤的方法进行：突变辅助克隆表达spacer载体，在其中加入启动子psf和终止子Term21，启动子psf和终止子Term21中间含有转录sgRNA的元件和酶切识别位点Ncol和Xbal，可以通过粘性末端酶切连接的方式插入spacer序列，得到改造后辅助克隆spacer的载体pHelp简称改造后pHelp载体）。质粒图谱见附图1，从图中可以看出：改造后pHelp载体包含表达盒甲，表达盒甲自上游至下游依次包括启动子psf，ncRNAl编码基因以及终止子Term21，nCRNAl编码基因中含有限制性内切酶Ncol和Xbal的识别序列，可用于将spacer序列克隆至改造后pHelp载体。[0080]改造后pHelp载体的核苷酸序列如序列1所示。表达盒甲的核苷酸序列为序列1第408-614位，其中，序列1第408-459位为启动子psf的核苷酸序列、第466-547位为ncRNAl编码基因，第554-614位为终止子Term21的核苷酸序列。[0081]2、改造转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9[0082]改造转录sgRNA的载体通过包括如下步骤的方法进行:突变转录sgRNA的载体中终止子后的序列，在其中引入氨苄青霉素抗性基因序列，同时在抗性基因序列两端引入酶切位点Nhel和Spel，得到改造后转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9简称改造后pCRISPR-Cas9载体）。质粒图谱见附图2。从图中可以看出：改造后PCRISPR-Cas9载体自上游至下游依次包括表达盒乙、限制性内切酶SpeI的识别序列、氨苄青霉素抗性基因序列Amp-0peron和限制性内切酶Nhel的识别序列；表达盒乙自上游至下游依次包括启动子ermE、ncRNA2编码基因和终止子to，ncRNA2编码基因中含有限制性内切酶NcoI和XbaI的识别序列。[0083]改造后pCRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如序列2所示。表达盒乙的核苷酸序列为序列2第3000-3384位，其中，序列2第3000_3113位为启动子ermE的核苷酸序列、第3120-3201位为ncRNA2编码基因，第3214-3384位为终止子to的核苷酸序列。限制性内切酶Spel的识别序列为序列2第3418-3423位、氨苄青霉素抗性基因序列Amp-0peron为序列2第3424_4498位，限制性内切酶NheI的识别序列为序列2第4499-45〇4位。[0084]3、耙序列spacer的设计及合成[0085]针对abyssomicin合成基因簇设计的spacer序列如下：5’-gctacggcatcgacctgacc-3’（序列4和5’-gggagatcgtgacgtcgagt-3’（序列5。设计的具体步骤如下：[0086]1选择以5’-NGG-3’结尾的23nt序列，包含spacer的20nt和PAM的3nt，将包含连续五个T的序列排除;其中，N是A或T或C或G;[0087]2将3,端的15个碱基，包含spacer的Unt和PAM的3nt，用B0WTIE进行序列比对，排除有多个比对位置的序列；[0088]3将B0WTIE生成的文件进行分析，去除非特异识别的spacer。[0089]最终合成两对单链DNA分子。每对单链DNA分子中的两条spacer退火形成带有Ncol和Xbal粘性末端的双链DNA分子。两对单链DNA分子的序列如下（下划线标记的碱基为粘性末立而：[0090]aby-spl-F正向引物）：catgggctacggcatcgacctgaccgttttagag；[0091]aby-spl-R反向引物）：ctagctctaaaacggtcaggtcgatgccgtagcc；[0092]aby-sp2_F正向引物）：catgggggagatcgtgacgtcgagtgttttagag；[0093]aby_sp2-R反向引物）：ctagctctaaaacactcgacgtcacgatctcccc〇[0094]4、3?〇61'克隆至改造后?临1?载体和?〇?18?]^-0339载体[0095]1用限制性内切酶Ncol和Xbal分别对改造后pHelp载体和改造后PCRISPR-Cas9载体进行酶切，分别得到带有限制性内切酶Ncol的粘性末端和限制性内切酶Xbal的粘性末端的骨架载体pHelp和骨架载体pCRISPR-Cas9,酶切体系（30uL如下:NcoI2uL、XbaI2uL、改造后pHelppCRISPR_Cas915uL、ddH2〇lluL。混勾离心后于37°C水浴，酶切4h以上。[0096]2将步骤3中设计并合成的单链DNA片段aby-spl-F和aby-spl-R进行退火反应，形成带有粘性末端Ncol和Xbal的双链DNA分子spacerl。[0097]将步骤3中设计并合成的单链DNA片段aby-sp2-F和aby-sp2-R进行退火反应，形成带有粘性末端NcoI和XbaI的双链DNA分子spacer2。[0098]上述退火反应体系（10yL如下:FQE向引物2uL、R反向引物2uL、10xcutsmartbufferlyUddHsO5此。混匀离心后于放入沸水中，自然冷却，进行退火反应。[0099]3分别将两个双链DNA分子和骨架载体进行连接，连接体系如下：SolutionItakara2此、片段1•8此、载体骨架0•2此。25°0金属浴恒温30min，将spacer连接到载体上，分别得到pHelp-spacerl载体和pCRISPR-Cas9-spacer2载体。转化大肠杆菌后，通过测序到筛选正确质粒。[0100]测序结果表明：pHelp_spacerl载体为将双链DNA分子spacerl替换改造后pHelp载体的Ncol和Xbal酶切位点间的DNA片段，且保持改造后pHelp载体的其他序列不变得到的载体。pHelp-spacerl载体含有sgRNAl的编码基因。[0101]口〇1?13?1?-〇389-3口3061'2载体为将双链0隐分子3口3。612替换改造后口0?13?1?-〇已39载体的Ncol和Xbal酶切位点间的DNA片段，且保持改造后pCRISPR-Cas9载体的其他序列不变得到的载体。pCRISPR-Cas9_spacer2载体含有sgRNA2的表达盒。[0102]5、同源臂插入pCRISPR-Cas9-spacer2载体[0103]1设计同源左右臂引物，在左右臂引物5’端分别加入20bp的同源序列，以便于后续利用Gibbson连接一步将左右臂连接至载体上，左右臂引物分别为：[0104]ABY-L-F：TCTCGTCGAAGGCACTAGAAGGTCATCGTGGACGCCGCTGCCCTC；[0105]ABY-L-R：GTGGGCGGCATCGTCCATGCTGTT；[0106]ABY-R-F：AGCATGGACGATGCCGCCCACCATGGATGGTTGTTATCGCCGTGTCGG；[0107]ABY-R-R：GCGGTCGATCCCCGCATATAGGCTGGTTCTTCACGATGAGGTCGCCGCT〇[0108]2以海洋疣孢菌MS100047基因组为模板，采用步骤1设计的特异性引物进行PCR，分别扩增出冋源左臂和冋源右臂，PCR反应体系如下：PrimerFliiL、PrimerRluL、5xReactionbuffer5uL、5Xhigh-GCenhancer5uL、dNTP2uL、模板DNAluL、Q50_2liL、ddH209•8ul。充分混匀后，使用PCR仪进行反应，反应条件为：1.预变性温度98°C，时间2分钟;2.变性温度98°C，30秒，退火温度72°C根据每对引物的不同适量调整），30秒，延伸温度72°C，40秒20seckb，总共30个循环;3.延伸温度72°C，延伸10分钟。反应结束后，使用1%琼脂糖凝胶电泳，回收产物。[0109]3使用限制性内切酶StuI酶切pCRISPR-Cas9-spacer2载体，得到线性化的pCRISPR-Cas9_spacer2载体。酶切反应体系（30uL如下：31：1111此4〇?13?1?-〇89-spaCer215此、ddH2014此。混匀离心后于37°C水浴，酶切4h以上，使用1%琼脂糖凝胶电泳，回收产物。[0110]4将线性化的pCRISPR-Cas9-spaCer2载体、同源左臂和同源右臂连接，得到pCRISPR-LR-Cas9_spacer2载体。连接反应体系如下：pCRISPR-Cas9-spacer2载体2uL、L左臂）2yL、R右臂）2yL、2x—步克隆试剂6此。50°：恒温60min，转化大肠杆菌中，验证，并提取质粒测序。[0111]6、将pHelp-spacerl载体上的spacer连接到pCRISPR-LR-Cas9-spacer2载体[0112]1用限制性内切酶Spel和Nhel对pCRISPR-LR-Cas9-spacer2载体进行酶切，得到骨架载体。酶切反应体系（30此）如下：SpeI2yL、NheI2yL、pCRISPR-LR-Cas9-spacer215yL、ddH201lyL。混匀离心后于37°C水浴，酶切4h以上，使用1%琼脂糖凝胶电泳，回收产物。[0113]2以pHelp-spacerl载体为模板，采用设计的通用引物pHelp-F和pHelp-R进行PCR扩增，得到PCR产物，其含有sgRNAl的表达盒。pHelp-F和pHelp-R引物序列如下：[0114]pHelp-F：GTCCAGTAATGACCTCAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC；[0115]pHelp-R:GCGTTCTGAACAMTCCAGAGCGGATAACMTTTCACACAGG。[0116]3将1获得的骨架载体和2中所获得的DNA片段连接，得到敲除质粒，即双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体。并对其进行测序验证。[0117]敲除质粒的核苷酸序列为序列3。敲除质粒依次包括双spacer的sgRNA表达盒、CAS9蛋白表达盒和靶基因的同源臂序列。[0118]双spacer的sgRNA表达盒含有sgRNAl的表达盒和sgRNA2的表达盒。sgRNAl的表达盒自上游至下游依次包括启动子ermE的核苷酸序列，sgRNAl的编码基因、终止子to的核苷酸序列，其中，启动子ermE的核苷酸序列为序列3第3〇0〇-3113位，sgRNAl的编码基因序列为序列3第3120-：3139位、终止子to的核苷酸序列为序列3第3234-：3404位。sgRNA2的表达盒自上游至下游依次包括终止子Term21的核苷酸序列、sgRNA2的编码基因和启动子psf的核苷酸序列，其中，终止子Term21的核苷酸序列为序列3第3500-3560位、sgRNA2的编码基因为序列3第3649-3668位、启动子psf的核苷酸序列为序列3第3675-3726位。[0119]CAS9蛋白表达盒自上游至下游依次包括用于启动CAS9蛋白的启动子tipA的核昔酸序列、CAS9蛋白的编码基因和终止子fd，其中，用于启动CAS9蛋白的启动子tipA的核苷酸序列为序列3第38〇〇_39〇〇位、CAS9蛋白的编码基因序列为序列3第3阳3-8〇39位、终止子fd的核苷酸序列为序列3第8087-9195位。[0120]靶基因的同源臂序列包括靶基因同源左臂的核苷酸序列和靶基因同源右臂的核苷酸序列。靶基因同源左臂的核苷酸序列为序列3第9219-11〇39位、靶基因同源右臂的核苷酸序列为序列3的第11040-12908位。[0121]二、双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体在敲除海洋疣孢菌aby基因簇中的应用[0122]l、aby敲除菌株的制备[0123]将步骤一制备的敲除质粒双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体导入海洋疣孢菌MS100047中，敲除海洋抚孢菌的aby基因簇，得到aby敲除菌株。具体步骤如下：[0124]1将敲除质粒转化E.coliET12567pUZ8002感受态细胞，E.coliET12567PUZ8002自身需要卡那霉素和氯霉素筛选抗性，故而筛选平板需要相应抗生素和卡那霉素、氯霉素作为筛选条件，37°C培养12-16h。[0125]2待三抗的平板长出克隆后，验证，挑取单克隆接种到对应的三抗LB液体培养基胰蛋白胨1〇gL，酵母提取物5gL，氯化钠1OgL中，进行扩大培养。[0126]3将过夜培养的细胞按1%的比例接种于新鲜的三抗LB液体培养基中，在37°C条件下摇箱培养，待0D600达到0•4-0•6时，离心收集细胞，并用无抗的LB液体培养基洗涤菌体三次，除去携带的抗生素，得到大肠杆菌菌液，待用。[0127]4挑取活化在平板上的海洋疣孢菌MS100047单克隆接种于加有弹簧的40mLVerOl培养基中培养3天，8000rpm离心lmin富集菌丝体，使用孢子过滤器过滤，收集分散度好的菌体，使用10%甘油清洗菌体两次，得到菌丝体悬液，备用。[0128]5将步骤3制备得到的大肠杆菌菌液和步骤4制备得到的菌丝体悬液在1.5mL离心管中混匀，均匀涂布于加有10mMMgCh的高天固体培养基，28°C培养；[0129]6培养ie_20h后，取lmL无菌水加入lmg萘啶酮酸、相应浓度质粒携带抗性基因的抗生素。使含有这两种抗生素的无菌水均匀覆盖平板，通风橱下吹干后，密封好置于28°C培养10-15d，直到有可见的转化子长出。[0130]7挑取长出的克隆划线于加有50mgL硫酸安普霉素和l〇mgL硫链丝菌肽的VerOl固体培养基，置于28°C培养约3_5d，挑取长出的克隆，再次挑取单克隆到相同抗生素的培养基上，选取在平板上长势良好的突变菌株，即为aby敲除菌株，并将其命名为海洋疣孢菌MS100047Aaby〇[0131]海洋疣孢菌MSlOOOCAaby为将海洋疣孢菌MS100047中的aby基因簇敲除，且保持海洋疣孢菌MS100047基因组其他序列不变得到的菌。[0132]2、aby敲除菌株的PCR鉴定[0133]1提取aby敲除菌株的基因组DNA[0134]选取在平板上长势良好的aby敲除菌株和野生菌株海洋疣孢菌MS100047，提取基因组DNA。具体步骤如下：挑取适量菌体到1.5mL的EP管中，加入180此溶菌酶溶液处理过夜;过夜处理的体系中加入2ul蛋白酶K溶液蛋白酶K终浓度为〇.18mgml，混匀，再加入lu110%的SDSSDS终浓度为0.5%，充分混勾，55°C处理l-2h，每l〇-15min缓慢颠倒混匀反应体系。加入lyLRNase溶液RNase终浓度为0.0911^111〇37。：处理0.5h;加入36uL5MNaClNaCl终浓度为〇•，缓慢充分混匀；加入20yLCTABNaCl，充分混匀并且55°C下孵育l^Omin;冷却至室温，加入5ml苯酚氯仿异戊醇，缓慢反复颠倒约1〇_15min;2〇。〇下13,500g呙心lanin;吸取上清，用等体积氯仿异戊醇抽提，缓慢反复颠倒约1〇—15min，13,5〇〇g离心15min;吸取上清至干净管子中，加入〇.6倍体积异丙醇，颠倒混匀后，13,5〇〇g离心15min，除去上清，使用70%乙醇清洗沉淀两次，晾干后，使用50yL水溶解。[0135]2PCR验证[0136]分别以海洋疣孢菌MS100047Aaby和海洋疣孢菌MS100047的基因组DNA为模板，选取同源左臂5’端外面一段序列和同源右臂5’端内部一段序列作为引物对甲（F1:cgctggtccgatctagcacc和R1:gaacgcccgctatccacg，同源左臂3’端内部一段序列和同源右臂3’端外部一段序列作为引物对乙（F2:cggtgtcacgccctgctc和R2:cggtgttgatgctcgcgc进行PdPCR反应体系如下：PrimerF0.5iiL、PriinerR0.5yL、2XHigh_GCPCRStarMixwithLoadingDye5此、模板DNA0.5liL、ddH2〇3.5此。？0?反应条件为：预变性温度95°C，时间5分钟;变性温度95°C，30秒，退火温度60°C，30秒，延伸温度72°C，120秒60秒kb，总共30个循环;延伸温度7YC，延伸10分钟。待反应结束后，取5iiL样品点样于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确。[0137]结果如图3所示:从图中可以看出：引物对甲和引物对乙在野生型菌株海洋疣孢菌MS100047中均没有PCR条带产生，而在海洋疣孢菌MSlOOOCAaby中均扩增出约2kb条带，说明aby基因簇被成功敲除。[0138]3、aby敲除菌株的发酵鉴定[0139]1菌株发酵：分别将aby敲除菌株和野生菌株海洋疣孢菌MS100047接种到40mLVerOl培养基中作为种子液培养3天，之后将种子液按照5%VV接种量接种于Ver〇l液体培养基，在28°C、200rpm条件下发酵培养8d，分别得到发酵液MS100047Aaby和发酵液MS100047〇[0140]2产物处理：用等体积乙酸乙酯萃取步骤1获得的发酵液，之后将乙酸乙酯相减压蒸馏，使用甲醇重新溶解，经0•22wn滤膜过滤后，使用HPLC分析发酵液MS100047Aaby和发酵液MS100047中的产物变化。本实验中使用的HPLC系统是Agilent120〇seriesHPLCsystem。检测器是紫外和可见光谱的diodearraydetectorDAD检测器。对于Proximicins的检测波长选用254nm吸收。分析色谱柱选用Z0RBAXSB-CNcolumn4.6mniXl5〇mm，Agilent，水、乙腈和0.1%三氟乙酸乙腈作为流动相，分析条件为:进样体积40yL，流速1.〇1^1^11，〇_1%三氟乙酸乙腈浓度为1〇%不变，前15111111乙腈相浓度由0%增加到45%，然后45%浓度维持lOmin，随后乙腈浓度在5min内梯度上升到90%，90%乙腈维持5min，再在lmin内降至0%，维持5min结束。[0141]HPLC检测结果如图4所示，和发酵液MS100047中的产物相比，发酵液MS100047△aby中的多环聚酮类抗生素abyssomicin的产量消失了，说明aby基因簇确实已经被成功敲除。

权利要求：1.一种CRISPR-Cas9载体，其包括双spacer的sgRNA表达盒和CAS9蛋白表达盒；所述双spacer的sgRNA表达盒表达名称为sgRNAl和名称为sgRNA2的两个sgRNA;所述CAS9蛋白表达盒表达CAS9蛋白；所述双spacer的sgRNA表达盒由名称分别为sgRNAl的表达盒和sgRNA2的表达盒连接而成；所述sgRNAl的表达盒和所述sgRNA2的表达盒的转录方向相反。2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9载体，其特征在于：所述sgRNAl的表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子甲的启动子、sgRNAl的编码基因和名称为终止子甲的终止子;所述启动子甲启动所述sgRNAl的编码基因的表达；或，所述sgRNA2的表达盒自上游至下游依次包括名称为终止子乙的终止子、sgRNA2的编码基因和名称为启动子乙的终止子;所述启动子乙启动所述sgRNA2的编码基因的表达；或，所述CAS9蛋白表达盒自上游至下游依次包括名称为启动子丙的启动子、CAS9蛋白的编码基因和名称为终止子丙的终止子;所述启动子丙启动CAS9蛋白的表达；或，所述启动子甲和所述启动子乙为不同或相同的启动子；或，所述终止子甲和所述终止子乙为不同或相同的终止子。3.根据权利要求1或2所述的CRISPR-Cas9载体，其特征在于：所述CRISPR-Cas9载体还包括靶基因的同源臂序列；或，所述靶基因的同源臂序列位于所述CAS9蛋白表达盒的下游；或，所述靶基因为abyssomicin基因簇；或，所述sgRNAl的编码基因序列为序列3第3120-3139位；或，所述sgRNA2的编码基因序列为序列3第3649-3668位；或，所述CAS9蛋白的编码基因序列为序列3第3933-8〇39位；或，所述同源臂序列由同源左臂序列和同源右臂序列组成；或，所述同源左臂序列为序列3第9219-11039位；或，所述同源右臂序列为序列3第11040-12908位。4.根据权利要求1-3中所述的CRISPR_Cas9载体，其特征在于:所述CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列为序列3。5.权利要求1_4中任一所述的CRISPR-Cas9载体在敲除靶基因中的应用；或，权利要求1-4中任一所述的CRISPR-Cas9载体在敲除放线菌靶基因中的应用。6.权利要求1-4中任一所述的CRISPR-Cas9载体的构建方法，包括如下步骤：1制备辅助克隆spacer的载体pHelp所述辅助克隆spacer的载体pHelp包括名称为表达盒甲的表达盒，所述表达盒甲自上游至下游依次包括权利要求2-4中任一所述的启动子甲、ncRNAl编码基因和权利要求2-4中任一所述的终止子甲，所述ncRNA1编码基因含有限制性内切酶A的识别序列和限制性内切酶B的识别序列；⑵制备转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9所述转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9包括名称为表达盒乙的表达盒和权利要求1-4中任一所述的CAS9蛋白表达盒，所述表达盒乙自上游至下游依次包括权利要求2-4中任一所述的启动子乙、ncRNA2编码基因、权利要求2-4中任一所述的终止子乙、限制性内切酶C的识别序列、抗性基因和限制性内切酶D的识别序列；所述ncRNA2编码基因含有限制性内切_A的识别序列和限制性内切酶B的识别序列；3制备带有限制性内切酶A的粘性末端、靶基因spacer序列1和限制性内切酶B的粘性末端的双链DNA分子甲；制备带有限制性内切酶C的粘性末端、靶基因spacer序列2和限制性内切酶D的粘性末端的双链DNA分子乙；⑷将所述双链DNA分子甲通过酶切连接替换所述辅助克隆spacer的载体pHelp中所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp，其含有权利要求1-4中任一所述的sgRNAl的表达盒；将所述双链DNA分子乙通过酶切连接替换所述转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9中的所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶B之间的片段，得到含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9,其含有权利要求1-4中任一所述的sgRNA2的表达盒；5将所述含有双链DNA分子甲的辅助克隆spacer的载体pHelp中sgRNAl的表达盒替换所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9中所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D之间的片段，得到CRISPR-Cas9载体。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤4和步骤5之间还包括将权利要求3中所述的靶基因的同源臂序列插入所述含有双链DNA分子乙的转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9中的步骤；或，所述IE基因spacer序列1为序列4;或，所述耙基因spacer序列2为序列5。8.权利要求6或7中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp和或权利要求6或7中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR_Cas9。9.权利要求6或7中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp和或权利要求6或7中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9在敲除靶基因中的应用；或，权利要求6或7中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp和或权利要求6或7中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9在敲除放线菌靶基因中的应用。10.—种用于敲除祀基因的成套产品，其包括权利要求6或7中所述的辅助克隆spacer的载体pHelp和或权利要求6或7中所述的转录sgRNA的载体pCRISPR-Cas9;或，权利要求10所述的成套产品在敲除靶基因中的应用；或，权利要求10所述的成套产品在敲除放线菌靶基因中的应用。

百度查询： 中国科学院微生物研究所 安徽大学 一种双spacer序列识别切割CRISPR‑Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用