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申请/专利权人：中国科学院上海生命科学研究院

摘要：本发明涉及miR‑145和MKK4在治疗或预防软骨损伤、退变及骨关节炎中的应用。具体而言，本发明涉及上调miR‑145的表达或活性的试剂和或下调MKK4的表达或活性的试剂在制备抑制软骨细胞外基质的降解、缓解骨关节炎引起的软骨退变、或治疗或缓解软骨损伤或骨关节炎用的药物中的应用。

主权项：1.上调miR‑145的表达或活性的试剂和或下调MKK4的表达或活性的试剂在制备抑制软骨细胞外基质的降解、缓解骨关节炎引起的软骨退变、或治疗或缓解软骨损伤或骨关节炎用的药物中的应用。

全文数据：miR-145和MKK4在治疗或预防软骨损伤、退变及骨关节炎中的应用技术领域[0001]本发明涉及miR-145和MKK4在治疗或预防软骨损伤、退变及骨关节炎中的应用。背景技术[0002]骨关节炎OA是一种以滑膜炎、关节软骨退行性病变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性进行性骨关节病，骨关节炎虽然从关节软骨起病，但影响整个关节结构，包括软骨下骨、韧带、滑膜、关节囊及关节外肌肉，最终因关节软骨全部脱失而导致关节畸形和功能丧失。[0003]关节软骨是一种富含细胞外基质、无血管、无神经的组织，软骨细胞只占其体积的2%-3%，其余为丰富的软骨基质，主要包括二型胶原、高分子的聚集蛋白聚糖aggrecan以及极度亲水的透明质酸。在骨关节炎早期，关节软骨表现出短暂的自我修复行为，包括生长因子，如骨形态发生蛋白-2BMP-2、胰岛素样生长因子-IIGF-I、骨形态发生蛋白-7BMP-7、抑制素M活化素TGF超家族成员），以及软骨外基质的合成增加，主要有Π型胶原、IV型胶原、K型胶原、XI型胶原、聚集蛋白聚糖。但是，随着骨关节炎病理进程的加剧，分解性的细胞因子急剧增加，同时诱发大量的基质降解酶产生，软骨组织最终走向降解。正常软骨组织功能的发挥需要软骨组织处于一个代谢稳态，即以C〇12al二型胶原）、AggreCan蛋白聚糖）、透明质酸合成为主的合成代谢与以MMP3基质金属蛋白酶3、MMP13基质金属蛋白酶13、Adamts-5解聚蛋白样金属蛋白5分泌为主的分解代谢处于动态平衡的状态。[0004]在骨关节炎OA发生早期软骨基质降解产生的ECM片段会刺激滑膜细胞产生滑膜炎症，从而释放大量炎症因子到关节腔，研究表明在软骨稳态破坏过程中发挥重要作用的炎症因子有TNF-a、IL-Ιβ、IL-6、IL-8、IL-17等，这些炎症因子通过激活软骨细胞中NF-kB、MAI3K等信号通路，引起p-P65、p-c-Jun以及p-ATF2等转录因子的入核，从而抑制Sox-9、Col2al、Aggrecan等基因的表达，同时开启MMP3、MMP13、Adamts5等基因的表达，并呈时间和剂量依赖关系，进一步加剧软骨基质的破坏。NF-kB、MAPK等炎症通路的激活呈级联放大作用，因此干预炎症反应的靶点分子应是处于炎症通路的上游分子，例如Traf3、Traf6、TAB2、IKKa以及MAPkinasekinasesMKKs。炎症因子在激活软骨细胞中NF_kB、MAPK等信号通路的同时，也会引起一系列miRNA表达水平的改变。发明内容[0005]本申请第一方面提供上调miR-145的表达或活性的试剂和或下调MKK4的表达或活性的试剂在制备抑制软骨细胞外基质的降解、缓解骨关节炎引起的软骨退变、或治疗或缓解骨软骨损伤或关节炎中的药物中的应用。[0006]在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、碳水化合物、脂类或小分子化合物。[0007]在一个或多个实施方案中，所述上调miR-145的表达的试剂为miR-145的表达载体。[0008]在一个或多个实施方案中，所述下调MKK4表达的试剂为敲除MKK4的载体。[0009]在一个或多个实施方案中，所述骨关节炎为衰老引起的自发性骨关节炎、关节不稳定诱导的骨关节炎、前交叉韧带撕裂诱导的骨关节炎或部分内侧半月板切除及内侧副韧带横断诱导的骨关节炎。[0010]本申请第二方面提供用于检测miR-145表达水平的试剂和或检测MKK4的表达水平的试剂在制备监测软骨退变、软骨损伤或骨关节炎用的试剂盒的应用。[0011]在一个或多个实施方案中，所述用于检测MKK4表达水平的试剂包括检测MKMmRNA水平过程中使用到的试剂和检测MKK4蛋白含量过程中使用到的试剂。[0012]本申请第三方面提供一种抑制软骨细胞外基质的降解、缓解骨关节炎引起的软骨退变、或治疗或缓解软骨损伤或骨关节炎的方法，所述方法包括以下任一个或两个步骤的组合：[0013]a上调对象中miR-145的表达或活性的步骤;和[0014]b下调对象中MKK4的表达或活性的步骤。[0015]在一个或多个实施方案中，所述方法包括给予所述对象:上调miR-145的表达或活性的试剂和或下调MKK4的表达或活性的试剂。[0016]在一个或多个实施方案中，所述试剂为核酸分子、碳水化合物、脂类或小分子化合物。[0017]在一个或多个实施方案中，所述上调miR-145的表达的试剂为miR-145的表达载体。[0018]在一个或多个实施方案中，所述下调MKK4表达的试剂为敲除MKK4的载体。[0019]本申请第四方面提供一种诊断骨关节炎或监测骨关节炎病情发展的方法，所述方法包括检测对象体液中miR-145和或MKK4的表达水平步骤。[0020]在一个或多个实施方案中，所述检测MKK4表达水平包括检测MKMmRNA水平和检测Camk2d蛋白。[0021]在一个或多个实施方案中，采用Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测所述mRNA的水平。[0022]在一个或多个实施方案中，采用Westernblot或ELISA检测蛋白的含量。[0023]在一个或多个实施方案中，所述体液为外周血。附图说明[0024]图1:TNF-α抑制软骨细胞合成代谢，同时促进分解代谢。（A大鼠OA模型分组:假手术组sham组，6只）、OA组分别于手术后15天、30天、45天、60天、90天取膝关节），qRT-PCR检测几种炎症因子（IL-lβ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22及VEGF表达水平。（BTNF-α1〇1^!111处理大鼠原代软骨细胞24小时，91?1'-?0?检测8«-9、〇〇1231、388代〇311、]\^0：-3、MMP-13及Adamts-5的表达水平，GAPDH做为内参。（CTNF-alOngml刺激软骨细胞15分钟，Westernblot分析NF-κΒ和MAPK信号通路下游分子JNK、p38、Erk、p65、c-Jur^PATF2W^.酸化水平。⑶TNF-al〇ngml处理软骨细胞48小时，Westernblot分析8^-9、〇〇1231、丽?-3、MMP-13、Adamts-5及C0X-2的表达水平，GAPDH做为内参。（ETNF-al〇ngml处理软骨细胞不同时间（0天、12小时、1天、2天、3天、5天），Westernblot分析sox-9、col2al、MMP_3、MMP-13、Adamts-5及C0X-2的表达水平变化。（F不同浓度的TNF-α0、I、5、10、20、40ngml处理软骨细胞48小时，Westernblot分析sox-9、col2al、MMP-3、MMP-13、Adamts-5C0X-2的表达水平变化。（G分别对软骨细胞做以下分组并做相应处理：DMSO组、TNF-α处理组0150组、84¥11-7082组、5?600125组、58203580组和？098059组），91?1'-?0?检测8«-9、3〇121、388代〇311、11?-3、11?-13及4^11^8-5的表达水平。〇1獻?1通路抑制剂预处理软骨细胞2小时，TNF-α处理48小时，Westernblot分析sox-9、col2al、MMP-3、MMP-13、Adamts-5及C0X-2的表达水平。（ITNF-a处理软骨细胞48小时，细胞免疫荧光检测◦ουαΚΜΜΡίΑΜΜΡ-Π、Adamts-5蛋白水平。标尺，20μπι。（JTNF-α处理软骨细胞20分钟，细胞免疫荧光检测P-p65、p-c-Jun和p-ATF2的入核情况。标尺，IOym。*P〈0·05，**P〈0·01，***P〈0·001。NS，无显著性差异。所有P值基于Student’stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0025]图2:TNF_a抑制软骨细胞中miR-145的表达。（A大鼠OA模型分组:假手术组（sham组，9只）、OA组分别于手术后15天、30天、45天、60天、90天取膝关节，6-9只）、0A+CC-5013组7-9只），ELISA检测血清中TNF-α及C2C的含量。⑶微阵列检测TNF-α刺激软骨细胞引起的miRNA表达谱变化，热图显示上调幅度最大的15个miRNA及18个下调的miRNA。（CqRT-PCR验证TNF-a刺激下miR-92a，miR_23b和miR-145的表达变化。⑶不同浓度的TNF-a作用于软骨细胞对miR-92a，miR-23b和miR-145的表达水平的影响。（EqRT-PCR检测OA病人软骨组织10例和正常软骨组织（10例）中miR-145的表达差异，ELISA分析OA病人软骨组织和正常软骨组织中TNF-α含量，HE染色分析OA病人软骨组织和正常软骨组织的形态差异，标尺，20μm。（FOA病人软骨组织中TNF-a与miR-145相关性分析。（G手术诱导的OA大鼠膝关节软骨组织中TNF-a与miR-145相关性分析。（HqRT-PCR检测来自sham组、OA组及0A+CC-5013组的软骨组织中miR-145表达水平。（INF-κΒ和MAI3K信号通路抑制剂（BAY11-7082、SP600125、SB203580和Η98059处理软骨细胞2小时后，TNF-α刺激24小时，qRT-PCR检测miR-145表达水平。（Jp65siRNA及其阴性对照分别转染进软骨细胞，48小时后qRT-PCR及Westernblot检测p65表达水平。（KP65siRNA，traf2siRNA，traddsiRNA及阴性对照分别转染进软骨细胞，Westernblot检测p65及p-p65，GAPDH做为内参。（Lp65siRNA，traf2siRNA，traddsiRNA及阴性对照分别转染进软骨细胞，48小时后给予TNF-α刺激，24小时后qRT-PCR检测miR-145表达水平。*P〈0.05,林P〈0.01，*林P〈0.00KNS，无显著性差异。所有P值基于Student’stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0026]图3:miR-145抑制TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。（A利用RNAiMax以20nM的终浓度将miR-145类似物，抑制剂转染进软骨细胞，转染后24小时抽取总RNA，qRT-PCR检测miR-145表达水平，U6做为内参。⑶转染24小时后，进行annexinV-FITC碘化丙啶双染，流式分析。（C流式分析定量结果。⑶转染miR-145类似物，抑制剂后24小时，TUNEL染色，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。标尺，l〇ym。E分别将miR-145类似物，抑制剂转染进软骨细胞，转染后24小时给予TNF-α刺激，24小时后抽取总RNA及总蛋白，Westernblot检测8〇叉-9、。〇121、丽？-3、丽？-13、厶111^8-5及0^-2。的1訂-?0?检测11?-3、11?-13^^11^8-4及Adamts-5的表达水平。（G细胞免疫荧光检测MMP-3、MMP-13及Adamts-5的蛋白表达水平。标尺，50μπι。（H分别将miR-145类似物，抑制剂转染进软骨细胞，转染后24小时分别给予TNF-α刺激不同时间（0小时、3小时、6小时、12小时），qRT-PCR检测MMP-3、MMP_13及Adamts-5的表达水平。*P〈〇.05，#P〈0.Ol，*#P〈0.OOlAS，无显著性差异。所有P值均基于Student’Stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0027]图4:MKK43’UTR区域含有miR-145的结合位点。⑷利用RNAiMax将miR-145类似物，抑制剂转染进软骨细胞，转染后48小时抽取总RNA和总蛋白，qRT-PCR检测map2k4表达水平。⑶Westernblot检测MKK4表达水平。（C分别将不同浓度梯度的miR-145类似物，抑制剂转染软骨细胞miR-145类似物：5nM、10nM、20nM;miR-145抑制剂：10nM、20nM、40nM，转染后24小时给予TNF-α刺激，24小时后收取总蛋白，Westernblot检测MKK4及p-MKK4表达水平。⑶利用Lipofectamine2000分别将miR-145过表达质粒及敲减质粒转染进软骨细胞，转染后48小时收取总RNA及总蛋白，qRT-PCR检测map2k4表达水平。（EWesternblot检测MKK4表达水平。（FTNF-a处理软骨细胞不同时间点（〇、1、3、6、12、24小时），qRT_PCR检测map2k4表达水平。（G将不同浓度的miR-145类似物5nM、10nM、20nM及其阴性对照分别转染软骨细胞，转染后24小时给予TNF-α刺激不同时间（如图所示），Westernblot检测MKK4表达水平。（HWTMKK43’UTR及MTMKK43’UTR双荧光素酶报告基因载体示意图。⑴将WTMKK43’UTR、MTMKK43’UTR双荧光素酶报告基因载体及空载体分别与miR-145类似物，抑制剂及其阴性对照在人骨肉瘤细胞系SWl353中共转染，24小时后检测荧光强度。⑴从SD大鼠不同组织（心、肝、脾、肺、肾、小肠、脑、肌肉、肌腱、软骨、骨及滑膜组织抽取总RNA，qRT-PCR检测map2k4表达水平。（K分别从OA病人软骨组织和自体正常软骨组织中抽取总蛋白，WesternbIot检测MKK4、p-MKK4、p-c-Jun、p-ATF2及C0X-2表达水平，GAPDH做为内参。（L通过横断内侧副韧带及外侧半月板韧带构建手术诱导的半月板不稳DMMOA大鼠模型，sham组为假手术组，手术后2个月取材，石蜡包埋，切片，并进行组织学分析，免疫组化检测MKK4及P-MKK4水平，标尺，50μπι。（M取OA病人软骨组织和自体正常软骨组织，石蜡包埋，切片，免疫组化检测ΜΚΚ4水平，标尺，50μπι。*Ρ〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001。吧，无显著性差异。所有P值均基于Student’stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0028]图5:miR-145负调控TNF-α引起的JNK、p38的磷酸化。（A利用RNAiMax将miR-145类似物及其阴性对照分别转染进软骨细胞，转染后48小时给予TNF-α刺激不同时间点（0、15、30、60、90、120分钟），收取总蛋白，168丨6«1131〇丨检测册-仙和1^?1通路关键信号分子?-JNK、Total-JNK、p_Erk、Erk、ρ-ρ38、ρ38、ρ-ρ65、ρ65、ΙκΒα、p-c-Jun、p_ATF2及p-MKK4，GAPDH做为内参。⑶利用RNAiMax将miR-145抑制剂及其阴性对照分别转染进软骨细胞，转染后48小时给予TNF-α刺激不同时间点（0、15、30、60、90、120分钟），收取总蛋白，168七6«1blot检测NF-κΒ和MAPK通路关键信号分子-1疆、1'〇丨1-爪144迚4迚4138438、口-ρ65、ρ65、ΙκΒα、p-c-Jun、p-ATF2及p-MKK4，GAPDH做为内参。（C将miR-145类似物、抑制剂及其阴性对照分别转染进软骨细胞，转染后48小时给予TNF-a刺激20分钟，细胞免疫荧光检测p-c-Jun和p-ATF2的入核情况，激光共聚焦显微镜下观察并拍照，标尺，ΙΟμπι。（D用SP600125+SB203580或DMSO处理软骨细胞2小时，然后将miR-145抑制剂及其阴性对照分别转染进软骨细胞，转染24小时后给予TNF-a刺激，24小时后收取总RNA，qRT-PCR检测sox-9、Co12al和aggrecan的表达水平。（EqRT-PCR检测MMP-3、MMP-13及Adamts-5的表达水平。*P〈0.05，*朴〈0.01，#朴〈0.001。吧，无显著性差异。所有P值均基于Student’stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0029]图6:敲减MKK4抑制TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。（A利用Lipofectamine2000分别将针对MKK4的3条siRNA及其阴性对照转染进软骨细胞，转染后48小时收取总RNA及总蛋白，qRT-PCR检测map2k4RNA水平，Westernblot检测MKK4蛋白水平。⑶将siRNA#l转染软骨细胞，48小时后收取总RNA及总蛋白，qRT-PCR检测map2k4RNA水平。CWesternblot检测MKK4蛋白水平。⑶分别将si-MKK4、si-HGK及其阴性对照转染软骨细胞，转染后48小时给予TNF-α刺激，24小时后收取总蛋白，Westernblot检测sox_9、col2al、MMP-3、MMP-13、Adamts-5及C0X-2表达水平。（E分别用含有空载体pGLVHl或sh-MKK4质粒的慢病毒以不同觀150、100感染软骨细胞，感染后72小时收取总8祖及总蛋白^1^0?检测map2k4RNA水平，Westernblot检测MKK4、p-MKK4及p-c-Jun蛋白水平。（F分别用含有空载体pGLVHl或sh-MKK4质粒的慢病毒感染软骨细胞，感染后48小时给予TNF-α刺激不同时间（0、6、12、24小时），qRT-PCR检测sox-9、co12aI、aggrecan、MMP-3、MMP-13及Adamts-5表达水平。（G分别用含有空载体pGLVHl或sh-MKK4质粒的慢病毒感染软骨细胞，感染后48小时给予TNF-α刺激，24小时后收取总蛋白，Westernblot检测sox-9、col2al、MMP-3、MMP-13、Adamts-5、COX-2、MKK4、p-MKK4、p-c-Jun及p-ATF2表达水平，GAPDH做为内参。（H将miR-145抑制剂及其阴性对照分别转染进软骨细胞，转染24小时后分别用含有空载体pGLVHl或sh-MKK4质粒的慢病毒感染软骨细胞，感染后48小时给予TNF-α刺激，24小时后收取总RNA，qRT-PCR检测MMP-3、MMP-13及Adamts-5的表达水平。*P〈0·05，林P〈0·01，*#P〈0·001C3NS，无显著性差异。所有P值均基于Student’stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0030]图7:敲减HGK抑制TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。㈧用SP600125或01^0处理软骨细胞2小时，了册-€[刺激不同时间点（0、15、30、60、90、120分钟），收取总蛋白，Westernblot检测p-JNK、Total-JNK及p-c-Jun。Φ用SB203580或DMSO处理软骨细胞2小时，TNF-α刺激不同时间点（0、15、30、60、90、120分钟），收取总蛋白，168七6«1131^检测？-p38、p38及p-ATF2。（C分别将si-MKK4、si-HGK及其阴性对照转染软骨细胞，转染后48小时给予TNF-a刺激不同时间点（0、15、30、60、90、120分钟），收取总蛋白，168七6«1131^检测？-了疆、1'0七1-几1、口138、口38、口-。-了1111、口-八丁卩2及口-]\014。（0用不同浓度的5?600125+SB203580联合处理软骨细胞0、2.5、5、10、20、40μΜ，2小时后给予TNF-a刺激15分钟，收取总蛋白，Westernblot检测卩-了服、1'〇七1-了服、卩-卩38、卩38、卩-：-]1111、卩-八丁卩2及卩-]\014。仿）利用Lipofectamine2000分别将针对HGK的3条siRNA及其阴性对照转染进软骨细胞，转染后48小时收取总RNA及总蛋白，qRT-PCR检测map4k4RNA水平。（FWesternblot检测HGK蛋白水平。（G将si-HGK及其阴性对照转染软骨细胞，转染后48小时给予TNF-α刺激不同时间（〇、6、12、24小时），qRT-PCR检测sox-9、col2al、MMP-3、MMP-13及Adamts-5表达水平。*P〈0·05，**P〈0.01，#*P〈0.001AS,无显著性差异。所有P值均基于Student’stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0031]图8:过表达MKK4促进TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。㈧分别用含有空载体pEF-la或Len-MKM质粒的慢病毒以不同MOI50、100感染软骨细胞，感染后72小时收取总RNA及总蛋白，qRT-PCR检测map2k4RNA水平。（BWesternblot检测MKK4、p-MKK4及p-c-Jun蛋白水平。（C分别用含有空载体pEF-la或Len-MKM质粒的慢病毒感染软骨细胞，感染后48小时给予TNF-α刺激不同时间（〇、6、12、24小时），qRT-PCR检测sox_9、col2al、aggrecan、MMP-3、MMP-13及Adamts-5表达水平。⑶分别用含有空载体pEF-la或Len-MKM质粒的慢病毒感染软骨细胞，感染后48小时给予TNF-α刺激，24小时后收取总蛋白，Westernblot检测sox-9、col2al、MMP-3、MMP-13、Adamts-5、C0X-2、MKK4、p-MKK4、p-c-Junp-ATF2表达水平，GAPDH做为内参。（E将miR-145类似物及其阴性对照分别转染进软骨细胞，转染24小时后分别用含有空载体pEF-la或Len-MKM质粒的慢病毒感染软骨细胞，感染后48小时给予TNF-α刺激，24小时后收取总RNA，qRT-PCR检测sox-9、col2al、aggrecan、MMP_3、MMP-13及Adamts-5表达水平。*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001。吧，无显著性差异。所有P值均基于Student’stest。数据以平均值土标准差表示，代表3次独立实验。[0032]图9:过表达MKK4促进TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。㈧动物实验示意图：取8周龄的雄性SD大鼠，切断内侧副韧带及外侧半月板韧带，一周后关节腔注射给药，每周给药2次，连续注射8周。⑶番红快绿染色分析DMSO组、SP60012组、SB203580组关节软骨基质的降解情况，标尺，50μπι。（C注射roS、miR-145激动剂miR-145Agomir、miR-145抑制剂miR-145Antagomir实验组膝关节番红快绿染色结果，标尺，50μηι。⑶注射Len-sh_MKK4慢病毒及Len-MKM慢病毒实验组膝关节番红快绿染色结果，标尺，50μπι。具体实施方式[0033]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。[0034]本文涉及调控对象软骨细胞外基质的降解的方法，该方法包括调控miR-145和或MKK4的表达或活性的步骤。[0035]本文中，“对象”可以是哺乳动物，优选是人。miR-145和MKK4通常为哺乳动物尤其是人的相应分子。[0036]可从相应的数据库如Genbank中找到这些分子的蛋白序列及其编码序列。例如，miR-145的序列可从miRbase数据库中获得，登陆号为ΜΜΑΤ0000851;ΜΚΚ4的序列可从NCBI数据库获得，登陆号为NC_005109.4。应理解的是，来自不同物种来源的miR-145和MKK4在氨基酸序列或核苷酸序列上可能存在一定的差异，甚至来自同一物种不同个体的这些分子也可能存在一定的序列差异，但只要这些分子的生物学功能与本申请所述的生物学功能相同或类似，这类分子均包括在本发明的范围之内。[0037]“调控”软骨细胞外基质的降解包括抑制软骨细胞外基质的降解和促进软骨细胞外基质的降解。对于需要抑制软骨细胞外基质的降解的情况，可通过上调miR-145的表达或活性和或下调MKK4的表达或活性而实现。对于需要促进软骨细胞外基质的降解的情况，可通过下调miR-145的表达或活性和或上调MKK4的表达或活性而实现。[0038]通常，可通过给予合适的试剂来实现miR-145和MKK4表达或活性的上调或下调。例如，下调或抑制miR-145和MKK4基因表达水平的试剂可包括但不限于:促进miR-145降解的试剂，针对MKK4基因的siRNA，抑制MKMmRNA翻译的试剂，敲除miR-145和MKK4基因的试剂，和特异性识别MKK4基因的导向核酸并对其进行剪切以降低其表达水平的试剂等。在某些实施方案中，可通过给予打靶载体而将miR-145和或MKK4全基因敲除，从而实现表达水平的降低。在某些实施方案中，下调miR-145的表达的试剂为miR-145抑制剂。在某些实施方案中，miR-145抑制剂为表达miR-145的反义互补序列的病毒载体如慢病毒载体）。[0039]适用于本发明的反义互补序列是那些能特异性结合细胞内成熟的miR-145,从而阻遏miR-145的作用的反义互补序列。可根据对象所表达的miR-145来设计其反义互补序列。适用于本发明的病毒载体如慢病毒载体可以是本领域周知的适合于哺乳动物，尤其是人体给药的病毒载体。[0040]下调或抑制MKK4蛋白活性的试剂可以是这些蛋白各自的特异性抗体。[0041]本文中，降低MKK4蛋白的活性包括使宿主细胞与对照细胞（野生型细胞）相比，MKK4蛋白的活性降低至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%，甚至完全不表达这些蛋白或完全检测不到这些蛋白的活性。[0042]也可通过在MKK4蛋白中引入突变而使其活性降低。本文中，MKK4蛋白的活性尤其指其在本申请所述的MKK4-JNKp38-c-JunATF-2这一中轴线发挥的促进或抑制软骨细胞外基质的降解的活性。因此，在某些实施方案中，在MKK4蛋白的功能域中引入致其相应活性减弱或丧失的突变。突变可以是1个或数个甚至更多（例如10个以上、20个以上、30个以上）个氨基酸的插入、缺失或取代。可通过给予作用于MKK4基因的试剂，使其所编码的MKK4蛋白的功能域中存在导致其相关生物学活性减弱或丧失的突变。这类试剂可改变MKK4基因的序列，导致所编码的MKK4蛋白存在相应的突变，从而具有减弱的活性，或活性丧失。例如，可通过同源重组技术用突变的MKK4基因替换野生型细胞中的MKK4基因，从而导致其表达弱活性或无活性的MKK4蛋白。[0043]miR-145和MKK4各自表达的上调可通过在宿主或宿主细胞中过表达这些分子而实现其表达的上调。例如，可利用本领域常规的技术构建适于在宿主细胞中表达这些分子的表达载体，并通过常规方法转入宿主细胞中，使得表达载体在宿主细胞中表达所述分子，从而实现其表达的上调。在某些实施方案中，可调控这些分子的上游基因的表达，从而提高这类分子的表达。例如，在某些实施方案中，可给予对象表达miR-145成熟序列的病毒载体如慢病毒载体），从而提高miR-145在对象细胞中的表达水平。[0044]通常，蛋白活性的提高指与野生型相比，蛋白活性具有至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%的提高；或者与野生型细胞相比，宿主细胞中的蛋白活性有至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%的提高。[0045]因此，本发明抑制软骨细胞外基质的降解的方法包括给予需要的对象:上调miR-145的表达或活性的试剂;和或下调MKK4的表达或活性的试剂。[0046]本发明促进软骨细胞外基质的降解的方法包括给予需要的对象：下调miR-145的表达或活性的试剂;和或上调MKK4的表达或活性的试剂[0047]本文的试剂可以是核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物和蛋白。本文中，核酸分子可以是例如siRNA、表达载体或打靶载体。小分子化合物通常指采用化学方法合成的分子量较低的化学合成化合物。蛋白包括特异性抗体。例如，试剂可以是与MKK4蛋白特异性结合的抗体。抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体或scFv。可采用本领域周知的方法制备MKK4蛋白的抗体，尤其是单抗。也可使用市售的抗体。在某些实施方案中，本发明的上述方法包括将过表达miR-145的病毒载体如腺病毒载体或过表达miR-145的反义互补序列的病毒载体如腺病毒载体注射到关节腔内，从而抑制或促进软骨细胞外基质的降解。[0048]上述试剂的给予方式和剂量可根据不同的对象、不同的病症以及不同的药剂形式给予。例如，在某些实施方案中，给药途径包括但不限于:直接裸RNA注射法;脂质体包裹RNA直接注射法;金包被RNA基因枪轰击法;繁殖缺陷细菌或复制缺陷腺病毒携带质粒DNA法;电穿孔法，等等。给予的剂量应是能使对象产生所需治疗或预防效果的量。可根据实际的治疗或预防情况，分若干次给予本发明的试剂或药物组合物。[0049]当以药物组合物的形式给予时，药物组合物中还可含有药学上可接受的赋形剂。例如，在制备药物组合物时，通常将所述试剂与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊、纳米颗粒形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，药物组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、纳米颗粒等。药物组合物还可含有其它成分，例如湿润剂、乳化剂、防腐剂如羟基苯甲酸甲酯和丙酯和甜味剂等。上述各试剂在药物组合物中的量应是治疗或预防有效的量。[0050]通常，所述试剂在药物组合物的含量应是治疗或预防有效量的；具体的含量或给药剂量可考虑给药途径、病人健康状况等因素考虑。[0051]本文所述的抑制软骨细胞外基质的降解的方法可用于治疗受益于软骨细胞外基质的降解的各种疾病或缓解受益于软骨细胞外基质的降解的各种疾病，例如缓解骨关节炎引起的软骨退变。因此，本发明上述方法可用于治疗软骨损伤、骨关节炎或缓解骨关节炎的症状。术语“治疗”和“缓解”具有本领域惯常理解的含义。例如，对象病情具有一定程度上的舒缓，均可认为达到了“缓解”的目的。本文中，骨关节炎包括但不限于衰老引起的自发性骨关节炎、关节不稳定诱导的骨关节炎、前交叉韧带撕裂诱导的骨关节炎、或部分内侧半月板切除及内侧副韧带横断诱导的骨关节炎。[0052]因此，在某些实施方案中，本发明提供上调miR-145的表达或活性的试剂和或下调MKK4的表达或活性的试剂在制备抑制软骨细胞外基质的降解用的药物、缓解骨关节炎引起的软骨退变用的药物、或治疗或缓解软骨损伤或骨关节炎用的药物中的应用。[0053]通过检测对象体液中miR-145和或MKK4基因的表达水平，也可诊断与软骨细胞外基质的降解相关的疾病，尤其是软骨损伤或骨关节炎，或监测该疾病的病情发展。因此，本发明也提供一种诊断骨关节炎或监测骨关节炎病情发展的方法，所述方法包括检测对象体液中miR-145和或MKK4的表达水平的步骤。[0054]检测对象体液中所述表达水平包括检测mRNA的水平和检测相应蛋白含量。可采用本领域常规的方法来进行所述检测。例如，对于mRNA的检测，可采用Northem杂交法、RT-PCR或RNA-seq;对于蛋白含量的检测，可采用Westernblot或ELISA。例如，可采用现有的试剂盒来检测相关蛋白的含量或水平。当检测蛋白水平时，可使用相应的抗体进行ELISA检测。这些都是本领域技术人员所熟知的。体液可以是例如外周血。[0055]因此，本文也提供用于检测miR-145表达水平的试剂和或用于检测MKK4表达水平的试剂在制备诊断和监测软骨细胞外基质的降解、软骨损伤或骨关节炎用的试剂盒的应用。[0056]用于上述检测的试剂包括检测其mRNA水平过程中使用到的试剂和检测其蛋白含量过程中使用到的试剂。用于检测的这类试剂可以是核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化合物和蛋白（如抗体）。例如，当采用ELISA进行检测或监测时，所述试剂包括但不限于相应蛋白的特异性抗体。当检测或监测mRNA水平时，所述试剂包括但不限于相应的引物序列和或探针序列，也包括进行PCR或其他生物学实验所需的试剂，例如相应的酶、溶剂和反应物等。在某些实施方案中，这类试剂还包括例如用于显色或其它便于进行定量或定性的物质。[0057]在某些实施方案中，本公开还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：用于检测miR-145表达水平的试剂和或用于检测MKK4表达水平的试剂。[0058]优选地，用于这些检测的试剂包括检测其mRNA水平过程中使用到的试剂和检测其蛋白含量过程中使用到的试剂，更优选为Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测mRNA水平以及Westernblot或ELISA检测蛋白含量时所用到的试剂，包括但不限于引物和探针，以及例如进行PCR所需的试剂。[0059]下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆:实验室指南》美国纽约州:冷泉港实验室出版社，1989所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。[0060]此外，应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例）中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。文中所用术语，除非另有说明，否则其具有本领域所惯常理解的含义。[0061]—、材料与方法[0062]1、骨关节炎病人关节软骨的获得及手术诱导的部分半月板摘除PMM大鼠OA[0063]模型的建立[0064]人关节软骨的获得主要来自于骨关节炎病人膝关节的全关节置换手术，同一病人的未受损软骨区域做为正常对照，本实验共取10例骨关节炎病人软骨组织。伦理批准由上海交通大学医学院附属第九人民医院医学伦理委员会完成，且所有参与者获得知情同意。[0065]本实验所用到的SD实验大鼠均购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物的饲养及实验流程均经过健康科学研究所动物福利与管理委员会批准。4%的水合氯醛麻醉SD大鼠，去除膝关节部位被毛，75%酒精消毒;正面切开膝关节皮肤，可看到白色的肌腱组织；切开肌腱内侧肌肉，将肌腱拨到膝关节靠外侧且固定，另一侧皮肤肌肉也固定，切断内侧副韧带，打开关节囊，以看到内侧半月板为准;将内侧半月板用刀片挑起，将连接本月板两端的韧带切断，造成部分半月板切除;假手术组仅打开膝关节处皮肤及肌肉，不切断任何韧带，缝合膝关节肌肉以及皮肤。在术后一周关节腔注射SP600125JNK通路抑制剂，ΙΟμΜS1460;Selleck，USA、SB203508Ρ38通路抑制剂，ΙΟμΜS1076;Selleck，USA、CC-5013TNF-α分泌抑制剂，1〇μΜS1029;Selleck,USA、miR-145激动剂（50μΜ、miR-145拮抗剂200μΜ、空载慢病毒Len-C及表达sh-MKK4Len-sh-MKK4或MKK4Len-MKM的慢病毒（IXIO9PFU,20μ1或相应等体积的溶剂DMS0orPBS。每周2次，连续注射7周。[0066]2、SD大鼠原代软骨细胞的分离培养[0067]颈椎脱臼法处死体重为180g左右的SpragueDawleySD大鼠（7周龄左右），75%酒精浸泡5-10分钟。超净工作台内，无菌条件下分离膝关节和髋关节的软骨组织，避免取到软骨下骨，PBS清洗两遍，并切成2mm3-3mm3大小的碎片。培养箱内用0·25%Trypsin-EDTAGibcoTM，Invitrogen37°C消化lOmins，含10%胎牛血清FBS的完全培养液终止消化并用PBS清洗两遍，以除去血清。培养箱内用0.02%的二型胶原酶消化软骨碎片5个小时，期间每隔30分钟摇晃一次，以加速消化，消化下的细胞接种至IOcm培养皿中。用含10%FBS，50Uml青霉素，50mgml链霉素（HyClone，Logan，Utah的DMEMF12=1:1Invitrogen，CarIsbad，CA完全培养液培养，于37°C，含5%⑶2的恒温培养箱中。当细胞生长至90%〜95%时，吸弃培养基，用PBS清洗两次，再用0·25%Trypsin-EDTAGibcoTM，Invitrogen37°C消化1分钟，之后轻轻拍打培养皿至细胞全部浮起，加入适量含10%FBS的DMEMF12=1:1完全培养液终止反应，用移液器反复抽吸若干次，室温300g离心5分钟收集细胞，弃上清后加入含10%FBS的DMEMF12=1:1完全培养液重悬细胞，随后按一传三的比例分别种植于若干培养皿中。细胞冻存的程序为：消化细胞—冻存液DMSO:DMEMF12:FBS=1:2:7重悬细胞—调整细胞浓度—4°C，40mins—-20°C，15mins—-80°C，过夜后转移至液氣罐。或利用程序降温盒使用前注入适量的异丙醇）：消化细胞—冻存液重悬细胞—调整细胞浓度—-80°C，过夜—移至液氮罐。细胞复苏时，从液氮罐中取出，旋紧冻存管盖子，迅速放入37°C水浴。待到溶解，将细胞悬液吸出，缓慢加入含10%FBS的DMEMF12=1:1完全培养液，并不断摇晃。反复抽吸若干次，室温300g离心5mins，弃上清，用含10%FBS的DMEMF12=1:1完全培养液重悬沉淀细胞，种植于培养皿中。[0068]3、寡核苷酸及质粒转染[0069]利用Lipofectamine2000分别将miR-145类似物（与miR-145序列相同的人工合成的双链寡核苷酸片段）、miR-145抑制剂与miR-145序列互补的单链寡核苷酸片段）、siRNAsp65siRNA、TRADDsiRNA、Traf2siRNA、MKK4siRNA和HGKsiRNA转染进原代软骨细胞，其中miR-145类似物和miR-145抑制剂的转染终浓度为20nM，而siRNA的转染终浓度为40nM。[0070]siRNA使用前瞬时离心，用RNase-freeH2O或者灭菌ddH20,配制成20μΜ储存液（如下表），分装保存，避免反复冻融尽量不超过5次）。实验过程中，产品于冰上放置。[0071]20μΜ储存液的配置参考[0072][0073]siRNA序列（SEQIDNO:45—62:[0075]4、组织学检测及免疫组织化学[0076]4.1本实验所采用的试剂及仪器[0077]PBS缓冲液：9gNaCl，1.44gNa2HPO4·7H20,0.25gKH2PO4·2H20,用IOOOmL超纯水配置，pH值调到7.2，高温灭菌后备用。4%多聚甲醛:PBS配制，调pH值至7.0。12.5%EDTA脱钙液:PBS配制，调pH值至7.0。抗原修复液:A液:0.IM梓檬酸:21.Olg柠檬酸溶于IL蒸馏水。B液:0.IM梓檬酸钠:29.41g柠檬酸钠溶于IL蒸馏水。450ml蒸馏水中加入9mlA液和41mlB液配制成工作液。3%过氧化氢溶液:30%过氧化氢溶液用蒸馏水稀释10倍。5%BSA:PBS配制。所有抗体MKK4abl31351;Abcam,Cambridge,UK，p-MKK4sc_101795;SantaCruz，p_c_Junab13671；Abeam,p-ATF29221；CelISignalingTechnology,p-JNK9912；CellSignalingTechnology，p_P38ab47363;Abcam，MMP-3sc_6839;SantaCruz，MMP_13sc-30073;SantaCruz和ADAMTS-5sc-83186;SantaCruz用含5%BSA的PBS配制hDAB显色试剂盒；倒置显微镜附1^〇]1，加口311;石錯切片机1^;^3312400，德国）；石錯包埋机ThermoShandon，英国）；红外线干燥箱766-2,上海）；石錯Leica，德国）。[0078]4.2HE染色及番红快绿染色[0079]术后8周取出膝关节，4%多聚甲醛固定12小时，随后12.5%EDTA脱钙两个月，组织脱水，包埋，切片。人关节软骨组织行HE染色，大鼠关节组织行番红快绿染色，中性树胶封片，封片后常温晾干1-2天，于显微镜下观察，并进行OARSI评分。[0080]4.3免疫组化[0081]1切片置于二甲苯I中15min;2切片置于二甲苯II中15min;3切片置于100%乙醇I中5min;4切片置于100%乙醇II中5min;5切片置于95%乙醇I中5min;6切片置于95%乙醇II中5min;7切片置于85%乙醇中5min;8切片置于75%乙醇中5min;9PBS润洗三次，每次3min;10将切片浸入已加热至沸腾的抗原修复液中，保持IOmin;11自然冷却后，PBS润洗三次，每次3min;12滴加3%过氧化氢溶液，室温下避光孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性；13I3BS润洗三次，每次3min;14滴加5%BSA，室温封闭半小时；15一抗，4°C过夜。阴性对照用I3BS代替一抗，其余步骤相同；16PBS润洗三次，每次3min;17HRP标记的二抗，室温1小时；18PBS润洗三次，每次3min;19除去PBS，每张切片加2滴或100μΐ新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察3-5min;20浸入自来水中终止显色；21苏木精染液染色5min，自来水冲洗;221%盐酸酒精溶液分化5s;23自来水冲洗，返蓝30min-lh;24切片用PBS轻轻润洗;25切片置于75%乙醇中Imin;26切片置于85%乙醇中Imin;27切片置于95%乙醇I中2min;28切片置于95%乙醇II中2min;29切片置于100%乙醇I中2min;30切片置于100%乙醇II中2min;31切片置于二甲苯中2min;32中性树胶封片；33封片后常温晾干1-2天，于显微镜下观察。[0082]5、MKK43’UTR载体构建[0083]5.1本实验所需的试剂及实验设备[0084]LB培养基：蛋白胨（tryptone，酵母提取物yeastextract，0X0ID公司（英）；限制性内切酶，PhusionDNA聚合酶，连接反应液，普通DNA聚合酶，Fermentas公司；质粒提取试剂盒，DNA凝胶纯化试剂盒，DNA产物纯化试剂盒，DH5a感受态细胞，天根生化科技北京）有限公司；琼脂糖，PCR仪器，BioWest公司；核酸蛋白测定仪，Eppendorf公司；多功能酶标仪，PE公司；引物合成，广州市锐博生物科技有限公司；序列测定，苏州金唯智生物科技有限公司。[0085]5.2实验步骤[0086]利用PCR方法，根据MKK4人）3’UTR序列信息设计其扩增引物，以293T细胞基因组DNA为模板PCR扩增MKK4基因的3’UTR序列，利用XbalXbal两个限制性内切酶将目的基因片段克隆到GV249载体上海吉凯基因生物技术有限公司）双荧光素酶报告载体中，所用的引物序列（SEQIDNO:63-64如下：[0087]5’-GATCGCCGTGTAATTCTAGAACATATTCATGAAATGTGG-3’；[0088]5,-CCGGCCGCCCCGACTCTAGAGCTGTGCAAGCTCTTCTC-3,。[0089]突变引物设计:设计两条序列完全互补的引物，使需突变的位点在引物的中间位置，两侧各有10-15个碱基，引物的GC含量多40%，Tm值多78°C。[0090]PCR;琼脂糖凝胶电泳;割胶回收;酶切;连接;转化;鉴定。[0091]6、荧光素酶报告基因实验[0092]制备被动裂解缓冲液IXPLB:将1倍体积的5XPassive裂解缓冲液PLB加到4倍体积的蒸馏水中。混合均勾。储存在4°C«1个月）C3LARII:用LuciferaseAssayBufferII溶解冻干粉LuciferaseAssaySubstrate。存于-20°C«1个月）aStopGlo:®试剂：取2.1ml50XStopGl〇.®Substrate加到105ml的StopGio®Buffer。在提供的棕色StopGlo®Reagent瓶中，振摇10秒。细胞裂解；用手动或配有单自动进样器的萤光发光仪进行检测。[0093]7、细胞免疫荧光[0094]吸弃培液细胞前一天以5XIO4个孔种于24孔板），PBS洗2次;4%多聚甲醛室温固定10分钟;PBS润洗2次快速），PBS洗2次，各5分钟;封闭液5%BSA，0.3%triton-X室温封闭1小时;4°C一抗（1:200过夜染色（I%BSA，0·3%triton-XPBS洗涤3次，各5分钟;二抗孵育2小时（1:1000，摇床上缓慢摇晃;PBS洗涤3次，各5分钟;Hochest33342lugml染色5分钟，PBS洗涤2-3次，各5分钟；拍照。[0095]8、细胞凋亡检测[0096]8.ITUNEL染色[0097]1PBS或HBSS洗涤一次。[0098]2如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。[0099]3用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。[0100]4用PBS或HBSS洗涤一次。[0101]5加入含0.1%TritonX-100的PBS，冰浴孵育2分钟。[0102]6配制TUNEL检测液[0103]7用PBS或HBSS洗涤2次。[0104]8在样品上加50μ1TUNEL检测液，37°C避光孵育60分钟。注意:孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。[0105]9PBS或HBSS洗涤3次。[0106]10用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm绿色荧光）。[0107]8.2流式检测细胞凋亡[0108]1收取细胞，用冰预冷的PBS洗2-3次；[0109]2配制IXannexin-bindingbuffer;[0110]3配制100ugml的PI工作液；[0111]4用IXannexin-bindingbuffer重悬细胞（浓度达IXIO6;[0112]5加5ul488AnnexinV和Iul100ugmlPI;[0113]6室温孵育15分钟；[0114]7孵育结束后，加入400ulIXannexin-bindingbuffer，轻轻混勾，放于冰上；[0115]8流式细胞仪检测（530nm和575nm。[0116]9、慢病毒载体构建及包装[0117]Len-C，Len-sh-MKK4及Len-MKM均购自上海吉玛生物有限公司，滴度为IxlO9TUml。以MOI=50-100感染原代软骨细胞后12小时换液，继续培养48-72小时后进行相应分析检测。[0118]Len-sh-MKK4慢病毒构建：[0119]载体信息：LV3pGLVHlGFP+Puro;[0120]所用引物序列为：[0121]5’-GATCCGGCAGATAATGGCAGTTAATTCAAGAGATTAACTGCCATTATCTGCCTTTTTTG-3’（SEQIDNO:65；[0122]5’-AATTCAAAAAAGGCAGATAATGGCAGTTAATCTCTTGAATTAACTGCCATTATCTGCCG-3’（SEQIDNO:66。[0123]Len-MKM慢病毒构建：[0124]载体信息：LV-5pEF-laGFP+Puro;[0125]所用引物序列为：[0126]5’-TTAAGCTTATGGCGGCTCCGAGCC-3’（SEQIDN0:67;[0127]5’-CGGGATCCTCAGTCGACATACATGGGA-3’（SEQIDN0:68。[0128]10、逆转录-聚合酶链式反应以及实时定量PCR[0129]1按照以下表格配制逆转录反应体系：[0130][0131]逆转录PCR程序：16°C，30min——42°C，Ih——85°C，5min。[0132]2按照以下表格配制cDNA逆转录反应体系：[0133][0134]混匀后，70°C，5min。立即置于冰上，Imin以上。反应体系中继续加入：[0135][0136]37°C,lh——95°C，5min。[0137]3RT产物稀释10倍后按以下反应条件做荧光定量PCR反应：[0138][0139]Real-timePCR程序：95cC，30s——95°C，5s;60°C，20s;72°C，30s40轮）——解离曲线一一4°C。[0140]所用引物序列（SEQIDNO:1—44如下：[0141][0142]11、蛋白印迹[0M3]11.1本实验中所用的仪器和试剂[0144]RIPA裂解液（申能博彩，上海）；PMSF:按照1:100的比例加入至RIPA裂解液（申能博彩，上海）；BCA蛋白定量试剂盒（PIERCE,Rockford,111;BSA蛋白标准品（PIERCE,Rockford,111;酶标仪（Safire2™，TECAN;Runningbuffer:T;ris3.03g，Glycine14.4g,SDSlg,溶于IL双蒸水；TransferbufTer:T;ris3.03g,Glycine14.4g,甲醇200ml，溶于800ml双蒸水，4°C预冷备用；TBSTbuffer:Tris2.42g，NaCl8g,溶于IL双蒸水，加入ImlTween-20;PVDF膜（Mi11ipore，0·22μπι;5%BSATBST配制）；一抗、二抗：Sox-9I:1000,ab26414；Abeam,Cambridge,MA,USA,Co12aII:1000,BSl07I；BioworldTechnology,St.LouisPark,MN,USA,MMP-31:500；sc-6839；SantaCruz,CA,USA,MMP-131:500；sc-30073；SantaCruz,CA,USA,Adamts-51:500；sc-83186；SantaCruz,CA,USA，C0X-21:1000，abl5191;Abcam,Cambridge,MA,USA，JNK、phospho_JNK、Erk、phosphor-Erk、p38、phospho_p38、p65、phosph〇-p65、IicBa、phosph〇-c-Jun、phosphor-ATF2、MKK4、phospho_MKK4、HGK1:1000，全部来自CellSignalingTechnology,Danvers，MA，USA，GAPDH1:5000,G9545,Sigma-Aldrich，HRP-偶联的二抗（I:1000,Ce11SignalingTechnology,Danvers，MA,USA;5Xloadingbuffersangon;胶片（Kodak，USA;自动冲片机MultiLine400，USA。[0145]11.2实验步骤[0146]细胞弃上清，预冷PBS洗一遍;加入RIPA裂解液含1%PMSF，冰上裂解15min;用细胞刮刀将细胞刮下，12,OOOrprn离心15min;取上清即为总蛋白，-80°C保存。BCA法蛋白定量；SDS-PAGE电泳;转膜;封闭；一抗;洗膜;二抗;洗膜;显色和压片。[0147]12、染色质免疫共沉淀12.1本实验中所用的仪器和试剂[0148]稀释缓冲液：0.01%SDS，l.l%TritonX-100，1.2mMEDTA,16.7mMTris-HCl,pH8.1，167mMNaCl;SDS裂解缓冲液，l%SDS，10mMEDTA，50mMTris，pH8.1;低盐洗涤液：0.1%SDS，l%TritonX-100,2mMEDTA，20mMTris-HCl，pH8.1，150mMNaCl;高盐洗涤液：0.1%SDS，l%TritonX-100,2mMEDTA，20mMTris-HCl，pH8.1，500mMNaCl;LiCl洗涤液：0.25MLiCl，l%IGEPAL-CA630，l%脱氧胆酸（钠盐），lmMEDTA，10mMTris，pH8.1;TE缓冲液：24mlofIOmMTris-HCl，ImMEDTA，pH8.0。[0149]12.2实验步骤[0150]A.交联：[0151]10cm培养皿细胞约2XIO7个），估计培养液体积，计算甲醛体积（10ml培养液加入270μ137%的甲醛，终浓度为1%，直接在培养液中加入甲醛，室温固定IOmintJpAlOXW氨酸（I.25Μ室温终止反应5min。吸干培养液，加入冰预冷PBS洗细胞3次冰上操作）。加入含有蛋白酶抑制剂cocktail的PBSlml，将细胞刮下来，吸入EP管中。4度，IOOOrpm离心5min收集细胞碎片。加入Iml含有蛋白酶抑制剂cocktail的SDS裂解液冰上裂解细胞10min。[0152]B.超声：细胞充分裂解后，分装与EP管中，200μ1管（大约4XIO6个细胞），冰水浴超声。12000rpm4度离心IOmin，取上清于冰预冷EP管中。上清可于-80度冻存。[0153]C.IP：[0154]准备含有蛋白酶抑制剂cocktail的稀释缓冲液，加入9倍于细胞裂解液体积的稀释缓冲液。加入60μ1的proteinAGagarose，4度摇动1小时后，3000rpm离心Imin，取上清，去掉琼脂糖珠子。吸取10%的preclear后的上清作为Input，4度保存，其余上清加入抗体4度摇晃过夜。加入60μ1的proteinAGagarose，4度摇晃1〜2h。离心，弃上清。洗珠子，每次摇晃洗3〜5min后，3000rpm离心Imin收集珠子。洗脱DNA蛋白复合物。[0155]D.纯化DNA:[0156]DNA蛋白解偶联:在200μ1洗脱液中（包括Input加入8μ15MNaCl，65度孵育4〜5h或过夜。加入ΙμΐRNaseA并于37度孵育30min。加入4μ10.5MEDTApH8·0，8μ1IMTris-HClpH6.5，1μ110mgml蛋白酶Κ，45度孵育1〜2h。用DNA纯化试剂盒纯化DNA。纯化的DNA产物用普通PCR检测。[0157]13、酶联免疫吸附测定法[0158]1准备:从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。[0159]2配液:用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。[0160]3加标准品和待测样本:取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μΜ待测样本孔中先加入待测样本10yL，再加样本稀释液40yL即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。[0161]4温育:37°C水浴锅或恒温箱温育30min。[0162]5洗板:弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置Imin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次也可用洗板机按说明书操作洗板）。[0163]6加酶标工作液:每孔加入酶标工作液50yL，空白对照孔不加。[0164]7温育:重复4的操作。[0165]8洗板:重复5的操作。[0166]9显色:每孔先加入显色剂A液50yL，再加入显色剂B液50yL，37°C避光显色15min。[0167]10终止:取出酶标板，每孔加终止液50yL，终止反应颜色由蓝色立转黄色）。[0168]11测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值0D值。[0169]12计算:根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。[0170]14、统计分析[0171]所有实验至少重复三次。数据以平均值土标准差mean土standarddeviation表示。对于基因相对表达分析，对照组的平均值定义为UStudent’st-test用于对两组数据进行统计分析。One-wayANOVA用于对多组数据进行统计分析。P〈0.05认为具有显著性差异。[0172]二、实验结果[0173]1.TNF-α通过激活NF-kB和MAPK信号通路抑制软骨细胞的合成代谢，同时促进分解代谢[0174]首先检测了在手术诱导的半月板不稳DMMOA大鼠发病过程中几种促炎症因子IL-10、TNF-a、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-22的表达变化。结果显示，在OA发生过程中IL-Ιβ和TNF-a的表达水平上升幅度最大（图I，A。[0175]从大鼠膝关节和髋关节分离培养原代软骨细胞，并给予TNF-a10ngml刺激，结果显示TNF-a在RNA和蛋白水平均可显著抑制sox_9、col2al和aggrecan的表达，同时促进MMP-3、MMP-13、Adamts-5及C0X-2的表达（图1，B、D、I。并且TNF-α的作用呈现时间和剂量依赖（图I，E、F。同时，TNF-a刺激软骨细胞可以显著促进NF-kB和MAH信号通路下游分子JNK、p38、Erk、p65、c-Jun和ATF2的磷酸化（图I，C，进而引起p-p65、p-c-Jun和p-ATF2的入核（图1，J。当分别给予NF-kB和MAPK信号通路抑制剂BAY11-7082、SP600125、SB203580和PD98059处理后，TNF-α对软骨细胞合成代谢的抑制作用以及对分解代谢的促进作用均明显减弱（图1，G、H。[0176]2.TNF_a负调控miR-145的表达[0177]为探究手术诱导的半月板不稳DMMOA大鼠发病过程中TNF-a是否扮演重要角色，在手术后一周关节腔注射TNF-a分泌抑制剂（CC-5013，结果显示CC-5013可以显著抑制TNF-a的分泌，并且可以有效地抑制C2C二型胶原降解产物的产生（图2，A。这一结果提示手术诱导的半月板不稳DMMOA大鼠发病需要依赖于TNF-a的产生。[0178]接下来，利用微阵列筛选软骨细胞中受TNF-a调控的microRNAJNF-a处理软骨细胞24小时后，15个microRNA被上调，18个被下调（图2,B。挑选出3个下调幅度最大的microRNAmiR-92a、miR-23b、miR-145用qRT-PCR来验证，结果显示miR-23b和miR-145均可以显著被TNF-α抑制（图2，C、D。由于miR-145在软骨细胞中表达更高，因此选择miR-145做进一步研究。[0179]进一步研究发现，在OA病人软骨组织中miR-145呈低表达水平（图2，E，同样地，手术诱导的OA大鼠膝关节软骨组织中miR-145也呈低表达水平，并且给予CC-5013处理后，miR-145表达水平有所恢复（图2，H。最有趣的是，在OA病人软骨组织以及手术诱导的OA大鼠膝关节软骨组织中miR-145与TNF-a均呈明显的负相关关系（图2，F、G。[0180]为了阐明TNF-a负调控miR-145所依赖的具体机制，用NF-κΒ和MAPK通路抑制剂分别处理软骨细胞，较之其他组，BAY11-7082可以最有效地抑制TNF-a对miR-145的负调控作用（图2，1。为了验证以上结果，在软骨细胞分别对p65、traf2和tradd进行敲减，结果显示口65表达水平被抑制80%左右（图2，刀，此外，？65、让€2和让11的敲减均可以明显抑制TNF-α引起的p65磷酸化（图2，K，且可以阻断TNF-α对miR-145的抑制作用（图2，L。以上结果表明，TNF-a通过tradd-traf2_p65轴来负调控miR-145的表达。[0181]3.miR-145负调控TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生[0182]为了探究miR-145对TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶的产生是否有调控作用，将miR-145类似物，抑制剂及其阴性对照转染进软骨细胞，转染终浓度为20nM。结果显示转染miR-145类似物后，软骨细胞中miR-145表达水平显著提高，相反，miR-145抑制剂则可以明显抑制miR-145的表达图3，A。为了排除转染miR-145类似物、抑制剂影响软骨细胞存活的可能性，利用流式及TUNEL染色检测转染后细胞存活状态，结果显示miR-145类似物、抑制剂转染进软骨细胞对细胞生长状态没有任何影响（图3，B、C、D，并且对sox-9、col2al和aggrecan的表达没有任何影响。有趣的是，过表达miR-145可以显著抑制TNF-α引起的丽卩-3、MMP-13、Adamts-4及Adamts-5的上调，抑制miR-145则可以促进TNF-a引起的MMP-3、MMP-13、Adamts-4及Adamts-5的产生（图3，E、F、G、H。因此，miR-145可以负调控TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶的产生从而抑制软骨细胞外基质的降解。[0183]4.miR-145直接靶向于MKK4[0184]为了进一步探究miR-145负调控TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶的产生的具体机制，通过生物信息学预测miR-145可能的革E基因。TargetScan数据库显示MKK43’-UTR区域含有高度保守的miR-145结合位点（图4，H。[0185]接下来验证这一预测结果。首先，分别将miR-145类似物和抑制剂转染进软骨细胞，结果显示过表达miR-145可以显著抑制MKK4在RNA及蛋白水平的表达，相反，抑制miR-145则可以上调MKK4的表达（图4，A、B。并且miR-145对MKK4的抑制作用呈剂量依赖（图4，C。同样地，将miR-145过表达质粒转染进软骨细胞，MKK4表达水平明显被抑制，相反，转染miR-145敲减质粒则可以上调MKK4的表达图4，D、E。[0186]为了更加明确在软骨细胞中miR-145对MKK4的靶向性，我们进一步关注内源性miR-145对MKMmRNA的调控作用，鉴于之前的结果显示TNF-α可以明显下调软骨细胞中miR-145的表达，而miR-145可以结合MKMmRNA3’UTR区域从而抑制其翻译，因此推测TNF-α刺激可以通过下调miR-145来调控MKK4水平。结果显示，用TNF-a刺激软骨细胞6小时以后确实可以分别从RNA及蛋白水平上调MKK4表达，当外源性转染miR-145类似物后，TNF-a对MKK4的上调作用则完全被抑制（图4，F、G。[0187]为了进一步验证miR-145对MKK4的靶向性，分别构建了野生型WTMKM3’UTR和突变型MTMKM3’UTR双荧光素酶报告基因载体。分别将WTMKK43’UTR及MTMKK43’UTR双荧光素酶报告基因载体分别与miR-145类似物和阴性对照在人骨肉瘤细胞系SW1353中共转染。荧光素酶结果显示miR-145类似物可以显著抑制MKK4WT3’UTR双荧光素酶报告载体活性，但对MTMKK43’UTR双荧光素酶报告载体不起作用（图4，1。以上结果表明miR-145可通过结合于MKK4的3’UTR种子区域而直接靶标MKK4在转录后水平抑制其表达。[0188]为了评估MKK4在OA发生发展过程中的作用，首先检测了MKK4在大鼠不同组织中的表达特异性。结果显示，相较于骨组织、滑膜组织以及肌腱组织，关节软骨高表达MKK4图4，J。另外，我们发现OA病人软骨组织中MKK4及P-MKK4水平均明显升高（图4，K、M;同样地，免疫组化结果显示手术诱导的大鼠OA模型软骨组织中MKK4及P-MKK4表达水平也明显升高（图4，L〇[0189]5.miR-145抑制TNF-a引起的JNK和p38的磷酸化[0190]MKK4是MKK家族成员之一，在细胞受到炎症因子刺激时MKK4发生磷酸化，进而直接磷酸化并激活JNK和p38，磷酸化的JNK和p38分别进一步磷酸化c-Jun和ATF2，p-c-Jun和P-ATF2入核调控一系列基因的转录。为了阐明miR-145调控TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶产生的具体分子机制，分别在软骨细胞中过表达、敲减miR-145，随后TNF-a刺激不同时间0、15、30、60、90、120分钟），168丨6^1131〇丨检测册-仙和]\^?1通路关键信号分子-爪1、Total-JNK、p_Erk、Erk、ρ-ρ38、ρ38、ρ-ρ65、ρ65、ΙκΒα、p-c-Jun、p_ATF2及p-MKK4。结果显示，过表达miR-145可以显著抑制TNF-a引起的JNK、p38的磷酸化，而Erk、p65的磷酸化水平没有明显改变;相反，敲减miR-145则促进TNF-a引起的JNK、p38的磷酸化（图5，A、B。同样地，进一步的研究发现，过表达miR-145可以明显抑制p-c-Jun和p-ATF2的入核，敲减miR-145则促进p-c-Jun和p-ATF2的入核（图5，C。以上结果表明miR-145在软骨细胞中主要通过抑制JNK、p38的磷酸化来负调控TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。[0191]用JNK和p38的抑制剂（SP600125+SB203580联合处理软骨细胞。如前所述，敲减miR-145对sox-9、col2al和aggrecan的表达没有任何影响，但SP600125+SB203580完全阻断了TNF-α对sox_9、col2al和aggrecan的抑制作用（图5，D;敲减miR-145可以协同促进TNF-a引起的MMP-3、MMP-13及Adamts-5的上调，但SP600125+SB203580处理可以完全阻断miR-145的作用（图5，E。因此，miR-145在软骨细胞中主要通过抑制JNK、p38的磷酸化来负调控TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生，抑制JNK和p38信号通路可以完全阻断miR-145对TNF-α引起软骨基质降解的负调控作用。[0192]6.敲减ΜΚΚ4可以抑制TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生[0193]为了进一步探究MKK4在TNF-a介导的软骨基质降解蛋白酶产生过程中所发挥的作用，以及miR-145对TNF-a介导的软骨基质降解的负调控作用是否需要依赖于MKK4，设计并合成了针对服14的3条特异性811?财（#1，即8卜]\«14-366;#2,8口8卜]\«14-701;#3，即8卜MKK4-973。将3条siRNA转染进软骨细胞，均可以明显降低MKK4的表达水平，且siRNA#l的敲减效率最高，达70%—90%图64、8、〇。最有趣的是，敲减^«4及其上游信号分子!《1均可以明显抑制TNF-a介导的sox-9和col2al的下调，而且显著抑制TNF-a引起的MMP-3、MMP_13、Adamts-5及C0X-2的产生（图6，D。[0194]为了进一步验证以上实验结果，将针对MKK4的shRNA包装成慢病毒，随后感染软骨细胞，结果显示带有sh-MKK4的慢病毒可以显著敲低MKK4的表达水平（图6，E。敲低MKK4可以显著抑制TNF-α刺激不同时间（6、12、24小时）引起的MMP-3、MMP-13、Adamts-5的上调，但对8«-9、3〇1231和388代〇311的1?祖水平没有任何影响（图6，？）。和上面结果一致，利用慢病毒敲减MKK4可以部分抑制TNF-α介导的sox-9和col2al的下调，且可以显著抑制TNF-α引起的MMP-3、MMP-13、Adamts-5及C0X-2的产生，同时可以明显抑制MKK4、c-Jun及ATF2的磷酸化图6，G。此外，发现敲减MKK4可以完全阻断miR-145抑制剂对TNF-α引起的MMP-3、MMP-13及Adamts-5上调的协同作用（图6，H。以上实验结果表明miR-145对TNF-a介导的软骨基质降解的负调控作用需要依赖于MKK4。[0195]7.敲减HGK可以抑制TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶的产生[0196]HGKMap4k4属于MAPKkinasekinasesMAPKKKs家族成员之一，可以特异性磷酸化并激活MKK4，从而激活MKK4下游信号分子。JNK通路抑制剂SP600125处理软骨细胞可以显著抑制TNF-α介导的JNK及c-Jun的磷酸化（图7，A，p38通路抑制剂（SB203580处理软骨细胞则可以明显抑制TNF-a介导的p38及ATF2的磷酸化（图7，B，SP600125+SB203580联合刺激软骨细胞可以有效地抑制1疆、？38、1104、^1111及4了?2的磷酸化，并呈剂量依赖（图7，D。鉴于HGK特异性磷酸化并激活MKK4，MKK4进而特异性激活JNK和p38，我们预测敲减HGK或MKK4可能具有类似SP600125+SB203580处理的效果。和预期结果一致，敲减HGK或MKK4均可以有效地抑制JNK和p38的磷酸化，进而抑制c-Jun和ATF2的磷酸化（图7，C。为了进一步明确HGK在TNF-a介导的软骨基质降解蛋白酶产生过程中的作用，设计并合成了针对HGK的3条特异性811?嫩#1，即8卜邢1-491;#2,8口8卜邢1-2990;#3，即8卜邢1-3230。将3条81尺祖转染进软骨细胞，均可以明显降低HGK的表达水平，且siRNA#3的敲减效率最高，达85%图7，E、卩）。敲低邪1可以显著抑制了册-€[刺激不同时间（6、12、24小时）引起的30121和88代011的下调，以及丁即-€[刺激不同时间（6、12、24小时）引起的1^3-3、和六111^-5的上调，但对8«-9和MMP-13的RNA水平没有影响（图7，G。[0197]8.过表达MKK4加剧TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶的产生[0198]根据以上实验结果，推测在软骨细胞中过表达MKK4可能会加剧TNF-a引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。为了验证这一假设，构建了MKK4过表达慢病毒，感染软骨细胞72小时后，MKK4的RNA及蛋白水平均明显升高（图8，A、B。过表达MKK4可以显著加剧TNF-a刺激不同时间（6、12、24小时）引起的丽？-3、丽？-13、厶^11^8-5的上调，但对8^-9、3〇1231和aggrecan的RNA水平没有任何影响（图8，C。有趣的是，利用慢病毒过表达MKK4可以在蛋白水平促进TNF-α介导的sox-9和col2al的下调，且可以显著加剧TNF-α引起的MMP-3、MMP_13、Adamts-5及C0X-2的产生，同时可以明显促进MKK4、c-Jun及ATF2的磷酸化（图8，D。此外，发现过表达MKK4可以完全阻断miR-145类似物对TNF-α引起的MMP-3、MMP-13及Adamts-5上调的抑制作用，且可以加剧TNF-α对sox-9和c〇12al的抑制作用（图8，E。以上实验结果表明，过表达MKK4可以加剧TNF-α引起的软骨基质降解蛋白酶的产生。[0199]9.MiR-145可以缓解手术诱导的半月板不稳DMMOA大鼠关节软骨的退变[0200]以上体外结果表明miR-145可以通过MKK4-JNKp38-c-JunATF2轴来负调控TNF-a介导的软骨基质降解蛋白酶的表达，为了进一步明确miR-145是否在体内也发挥同样的功能，我们构建了手术诱导的半月板不稳DMM大鼠OA模型，实验分为假手术组n=6-8和DMM组n=6-8，手术后一周DMM组大鼠关节腔分别注射DMS0、JNK通路抑制剂（SP60012、P38抑制剂（SB203580、PBS、miR-145激动剂（miR-145Agomir、miR-145抑制剂（miR-145Antagomir、Len-sh_MKK4慢病毒及Len_MKK4慢病毒（图9，A。每周注射2次，8周后取膝关节进行组织学分析，番红快绿染色结果显示SP60012、SB203580、miR-145Agomir及Len-sh-MKK4慢病毒可以显著抑制OA大鼠关节软骨的退变，相反，miR-145Antagomir和Len-MKM慢病毒则加剧OA大鼠关节软骨的退变图9，B、C、D。[0201]三、讨论[0202]OA的发生从根本上是由于不正当机械应力和促炎性细胞因子IL-Ιβ和TNF-α发挥最主要的作用）激活软骨细胞中炎症通路（主要是NF-kB和MAPK，使丽Ps和ADAMTS转录上调，从而打破了软骨细胞合成代谢和分解代谢的失衡。和之前的研究结果一致，我们的研究结果表明，IL-Ιβ和TNF-α在我们构建的手术诱导的半月板不稳大鼠OA模型发病过程中扮演最主要的致炎细胞因子。IL-Ιβ与软骨破坏有关，TNF-α则负责驱动炎症级联反应。最初TNF-α在OA发生过程的重要作用被重视是由于OA病人软骨细胞中TNF-α受体p55的表达明显高于正常软骨细胞，因此OA病人软骨细胞对TNF-a的刺激表现得更加敏感，从而加剧了TNF-a介导的软骨基质降解，此外，OA软骨较正常软骨产生更多的肿瘤坏死因子转化酶TACE。[0203]然而在软骨细胞中对TNF-a响应性表达的miRNA目前还没有报道。在本研究中，我们初步确定在软骨细胞中TNF-a刺激可以显著下调miR-145的表达水平，并且在OA的病理过程中随着TNF-a的分泌miR-145表达水平明显降低，此外，TNF-a分泌抑制剂CC-5013可以明显抑制OA过程中软骨基质降解，最有趣的是CC-5013可以部分恢复miR-145的表达水平，以上结果表明在OA发生过程中miR-145与TNF-a存在负相关关系。进一步研究发现在软骨细胞中过表达miR-145可以显著抑制TNF-a诱导的MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的产生，相反，抑制miR-145则明显促进TNF-a诱导的MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的上调。我们发现MKK4是miR-145的一个靶基因，并且miR-145通过负调控MKK4的蛋白水平从而抑制MKK4的磷酸化，进而抑制JNKp38的磷酸化以及p-c-Junp-ATF-2的入核，最终调控软骨退变相关基因的转录。我们惊奇地发现MMP-13和Adamts-5的启动子区域均含有AP-I的结合位点，并且敲减MKK4可以完全废除miR-145抑制剂对TNF-α介导的炎症反应的促进作用，同样地，过表达MKK4则完全废除miR-145激动剂对TNF-a介导的炎症反应的抑制作用。从而我们推测miR-145负调控调控TNF-a诱导的软骨退变是通过MKK4-JNKp38-c-JunATF-2轴来实现的。体内实验进一步证实了以上结果，JNK通路抑制剂（SP60012、p38抑制剂（SB203580、miR-145激动剂Agomir-145及MKK4敲减慢病毒Len-sh-MKK4可以显著抑制OA大鼠关节软骨的退变，相反，miR-145抑制剂Antagomir-145和MKK4过表达慢病毒Len-MKM则加剧OA大鼠关节软骨的退变。[0204]我们的研究首次发现，TNF-α刺激可以显著下调miR-145的表达，并且关节软骨中miR-145的水平在OA发展进程中与TNF-a的分泌呈负相关。阻断NF-kB信号通路或敲减p65均可以部分挽救TNF-a引起的miR-145的下调，这一结果表明TNF-a对miR-145的负调控作用依赖于经典的NF-kB信号通路。出乎意料的是，IL-Ιβ刺激对软骨细胞中miR-145的表达水平并没有影响，这提示其他信号通路可能同时参与了对miR-145的表达调控。[0205]过表达miR-145可以显著抑制TNF-a诱导的MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5转录及转录后水平的升高。相反，抑制miR-145则明显加剧TNF-a诱导的MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的产生。此外，过表达或敲减miR-145均对软骨细胞的生长状态没有任何影响。因此，miR-145由于能够广泛地抑制TNF-a诱导的基质蛋白酶的产生而可能成为更加有效的缓解OA引起的软骨退变的治疗靶点。奇怪的是，过表达或敲减miR-145均不影响TNF-a诱导下Sox-9、Col2al和Aggrecan的mRNA水平，然而过表达miR-145却可以在蛋白质水平上部分挽救TNF-α对Sox-9和Col2al的抑制作用，这可能归因于过表达miR-145抑制了基质蛋白酶对Sox-9和Col2al的降解。这些结果提示我们，MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的启动子区可能存在c-Jun和ATF2的结合位点，因此可以被miR-145通过MKK4-JNKp38-c-JunATF-2轴直接调控，而Sox-9、Col2al和Aggrecan因启动子区缺少c-Jun和ATF2的结合位点而不能被miR-145直接调控其转录水平。[0206]MAPK和NF-κΒ信号通路参与调控软骨细胞中MMPs和ADAMTS的表达已被广泛报道，已有研究表明三个主要的MAP激酶JNK、p38、ERK和NF-kB在关节软骨退变中发挥主要作用。由于炎症反应呈级联放大作用，这提示我们处于炎症通路上游的蛋白质激酶，特别是参与NF-κΒ和MAPK信号通路的上游分子可能在OA的病理过程中起重要的炎症级联驱动作用。以往的一些研究表明，celecoxib——C0X-2抑制剂通过阻断NF-κΒ和JNK降低软骨细胞中ΜΜΡ-1、ΜΜΡ-3的产生，而hyaluronan通过抑制p38来负调控MMP-I和MMP-13的在软骨细胞中的表达。MKK4和MKK7均可以激活JNK，MKK4同时可激活p38。本文首次证明了MKK4参与调控软骨细胞中MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表达，且MKK4的3’UTR区含有一个高度保守的miR-145结合位点。我们的结果证实MKK4是miR-145的靶基因，并且MKK4在OA病人受损软骨组织中比未受损区域的软骨组织中表达水平更高，此外，相较于假手术组，MKK4及P-MKK4在DMM模型组软骨组织中表达更高。敲减MKK4显著抑制TNF-α诱导的MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的表达，过表达MKK4则促进TNF-a诱导的MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5的产生。此外，敲减MKK4有效阻断miR-145抑制剂对TNF-a诱导MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5上调的协同作用。相反，过表达MKK4则可以完全阻断miR-145对TNF-a引起的基质蛋白酶上调的抑制作用，以上结果表明miR-145对TNF-a介导的软骨退化的抑制作用是MKK4所介导的。MKK4可以被多种MKKKs激活，如ASK、MEKK和TAK，磷酸化的MKK4进而特异性磷酸化JNK和p38。我们的结果表明，在软骨细胞中TNF-a可以强烈激活JNK和p38,敲减MKK4或其上游分子HGK则可以显著抑制JNK和p38的磷酸化。[0207]综上所述，我们的研究结果表明，miR-145是第一个被发现的在软骨细胞中对TNF-a呈响应性低表达的miRNA，过表达miR-145则反过来抑制TNF-a介导的基质蛋白酶的产生，并且是通过调节MKK4-JNKp38-c-JunATF-2轴来实现的。我们的研究结果发现了miR-145和MKK4在OA引起的软骨基质降解中的新机制并可能被做为潜在的治疗OA的靶点。

权利要求：1.上调miR-145的表达或活性的试剂和或下调MKK4的表达或活性的试剂在制备抑制软骨细胞外基质的降解、缓解骨关节炎引起的软骨退变、或治疗或缓解软骨损伤或骨关节炎用的药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为核酸分子、碳水化合物、脂类或小分子化合物；优选地，所述上调miR-145的表达的试剂为miR-145的表达载体;所述下调MKK4表达的试剂为敲除MKK4的载体。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述骨关节炎为衰老引起的自发性骨关节炎、关节不稳定诱导的骨关节炎、前交叉韧带撕裂诱导的骨关节炎或部分内侧半月板切除及内侧副韧带横断诱导的骨关节炎。4.用于检测miR-145表达水平的试剂和或用于检测MKK4表达水平的试剂在制备监测软骨细胞外基质的降解、软骨损伤或骨关节炎病情进展用的试剂盒中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于检测MKK4表达水平的试剂包括检测MKMmRNA水平过程中使用到的试剂和检测MKK4蛋白含量过程中使用到的试剂。6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒含有：采用Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测所述mRNA的水平的试剂;和或采用Westernblot或ELISA检测蛋白含量的试剂。7.—种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有用于检测miR-145表达水平的试剂和或用于检测MKK4表达水平的试剂。8.—种抑制软骨细胞外基质的降解、缓解骨关节炎引起的软骨退变、或治疗或缓解软骨损伤或骨关节炎的方法，其特征在于，所述方法包括以下任一个或两个步骤的组合：a上调对象中miR-145的表达或活性的步骤;和⑹下调对象中MKK4的表达或活性的步骤。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括给予对象:上调miR-145的表达或活性的试剂和或下调MKK4的表达或活性的试剂。10.—种诊断骨关节炎或监测骨关节炎病情发展的方法，其特征在于，所述方法包括检测对象体液中miR-145和或MKK4的表达水平步骤；优选地，所述检测MKK4表达水平包括检测MKMmRNA水平和检测MKK4蛋白；优选地，采用Northern杂交法、RT-PCR或RNA-seq检测所述mRNA的水平;采用Westernblot或ELISA检测蛋白的含量；优选地，所述体液为外周血。

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