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摘要：本发明提供了一种标记植物泛素化修饰蛋白的重组蛋白及其应用，该重组蛋白包括：邻近标记酶和泛素蛋白，所述邻近标记酶和泛素蛋白通过肽键偶联。本发明利用邻近标记酶偶联泛素蛋白的重组蛋白，对底物蛋白进行泛素化修饰，借助邻近标记酶的特点，对与泛素蛋白邻近的底物蛋白进行生物素化标记；该重组蛋白及配套方法可以在不依赖于抗体且可变性条件下富集不同修饰类型的泛素化修饰蛋白不具有选择性，大大降低了富集泛素化修饰蛋白的成本，且富集效率高，非特异性富集少。
主权项：1.一种富集植物泛素化修饰蛋白的方法，其特征在于，包括：（1）采用基因工程手段，在目标生物体中表达重组蛋白；所述生物体为植物、植物组织或植物组织细胞；所述重组蛋白由邻近标记酶、泛素蛋白和蛋白标签组成，所述邻近标记酶的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；邻近标记酶编码基因的碱基序列如SEQIDNo.4所示；所述泛素蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；泛素蛋白编码基因的碱基序列如SEQIDNo.6所示；所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；重组蛋白编码基因的碱基序列如SEQIDNo.2所示；（2）使用生物素处理目标生物体，进行植物泛素化修饰蛋白的标记，得到标记泛素化修饰蛋白的目标生物体；（3）提取目标生物体的总蛋白，沉淀生物素标记的泛素化修饰蛋白后，去除游离的生物素，再通过溶解的方式，获得含有生物素标记的泛素化修饰蛋白的溶液；采用变性蛋白提取缓冲液提取目标生物体的总蛋白；该变性蛋白提取缓冲液包含可使样品目标生物体中蛋白质变性的变性剂、缓冲液、蛋白酶抑制剂及去泛素酶抑制剂；所述变性剂为1%重量SDS；缓冲液为pH7.5的50mMTris-HCl和150mMNaCl；去泛素酶抑制剂为5mMNEM；采用沉淀剂沉淀生物素标记的泛素化修饰蛋白，沉淀剂为预冷的丙酮；所述溶解所采用的溶解缓冲液为20mMTris-HClpH7.5，150mMNaCl，1%SDS；（4）利用生物素结合蛋白在步骤（3）的溶液中进行蛋白富集处理，再经洗涤和洗脱，得到生物素标记的泛素化修饰蛋白。
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百度查询： 湘湖实验室(农业浙江省实验室) 标记植物泛素化修饰蛋白的重组蛋白及其应用
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