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申请/专利权人：中南大学湘雅二医院

摘要：本发明涉及疾病动物模型技术领域，具体为一种开角型青光眼疾病动物模型的构建方法，从开角型青光眼致病机理出发，通过前房注射IFN‑γ诱导小梁网细胞坏死性凋亡，从而引起小梁网活性抑制、功能受损，引起眼压升高，进一步导致青光眼性视神经改变。该动物模型眼部病理生理改变与人类开角型青光眼类似：房角开放、小梁网功能受损、眼压升高、视网膜神经节细胞retinalganglioncells，RGCs丢失。该青光眼动物模型的制备具有创新性，具有较大优势及可实施性，造模成功率高、诱导周期短、眼压涨幅明显且稳定、操作相对简单，不通过堵塞小梁网或机械损害正常眼房水外流解剖结构来升高眼压，更符合原发性开角型青光眼病理生理改变。

主权项：1.一种开角型青光眼疾病动物模型的构建方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤S1：选取SPF级C57BL6J小鼠、SD大鼠、日本大耳白家兔作为造模对象：C57BL6J小鼠年龄在6～8周龄，SD大鼠年龄在4～8周龄，日本大耳白家兔年龄在12～14月龄；步骤S2：高眼压模型建立：麻醉方式：称重造模动物后，以40～50mgkg的剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉剂诱导C57BL6J小鼠及SD大鼠全身麻醉，以22～44mgkg的剂量肌肉注射盐酸氯胺酮麻醉剂诱导家兔全身麻醉，确认动物处于深度麻醉后，辅以盐酸丙美卡因滴眼液进行眼部表面麻醉；IFN-γ注射液制备：将不同种属IFN-γ母液使用PBS缓冲液分别稀释为9000Unitsml、20000Unitsml、30000Unitsml；前房注射：1小鼠大鼠①将麻醉好的小鼠大鼠置于手术显微镜操作台，操作台下方铺有体温保持装置的垫子防止术中小鼠大鼠体温降低，单眼朝上，使用消毒棉签蘸取碘伏消毒睑缘、整理睫毛、暴露眼球，使用灭菌的PBS或氧氟沙星抗生素滴眼液冲洗眼表，再用干消毒棉签擦除眼表残留的液体及其他碎屑；②采用显微无齿镊固定眼球，先用34G针头于瞳孔边缘外约2mm处作一细小穿刺口并释放出部分房水，用连接33G针头的微量注射器量程为10μl倾斜25°经原角膜穿刺口注射IFN-γ小鼠：1μl，大鼠：3μl，接着缓慢注射2μl空气在前房内形成一个完整气泡，注射后微量注射器针头于前房内适当位置停留30s，然后缓慢退出针头，使气泡自行封闭角膜穿刺口，起到防止注射试剂返流的作用；气泡在数小时内可被吸收，穿刺注射过程中要小心操作，防止针头刺伤虹膜及晶体前囊；实验组注射试剂为IFN-γ，对照组注射试剂为等体积PBS；③手术操作后，用氧氟沙星抗生素眼膏涂眼预防感染，将小鼠放在动物体温保持装置上维持体温，等待其自然复苏，待复苏后再放回动物饲养室；④每周重复一次前房注射，以维持前房IFN-γ浓度；2家兔①将麻醉好的家兔直接置于手术操作台，消毒准备工作同小鼠大鼠；②采用显微无齿镊或无菌棉签固定眼球，先用30G针头于角巩膜缘处做一穿刺口并释放出部分房水，再用连接30G针头的微量注射器量程为100μl倾斜25°经原角膜穿刺口注射IFN-γ家兔：55μl，注射后针头于前房内适当位置停留30s，然后缓慢退出针头，用无菌棉签按压封闭穿刺口，防止注射试剂反流；剩余操作部分同小鼠大鼠；眼压测量：1小鼠大鼠①气体吸入麻醉：每次眼压测量前均采用2-4％异氟烷混合95％氧气来麻醉小鼠大鼠，将其置入气麻机3-5分钟，通过挤捏小鼠大鼠脚趾或者观察眨眼反射来判断是否失去知觉以判断麻醉效果，同时辅以盐酸丙美卡因滴眼液进行眼部表面麻醉；②TonoLab回弹式眼压计的使用：TonoLab回弹式眼压计具有测量小鼠和大鼠两个校正模式Π＝小鼠，r＝大鼠，在测量时要将回弹的针头对准小鼠大鼠角膜中央，并保持眼压计位于水平位置，同时与小鼠大鼠角膜表面垂直；注意测量过程中手握小鼠大鼠要尽量避免对其颈部及眼眶施加压力，否则会人为地导致眼压升高；在小鼠大鼠吸入麻醉后，使用TonoLab回弹式眼压计测量眼压，全部眼压的测量均由同一操作人员在相同时间段内测量；TonoLab回弹式眼压计可以自动将6次连续测量值通过内置软件去掉最高及最低值后计算产生一次完全测量值，在小鼠大鼠失去知觉后2分钟内完成5次完全测量，之后取5次完全测量眼压的平均值最为最终眼压值；③眼压测量时间点：基础眼压测量在首次眼前房注射前，建议测量时间选在早上8-10点，在眼前房注射后的每隔一天测量一次眼压，期间每隔1周重复一次前房注射，监测4周后，若眼压升高平稳可每隔一周监测一次眼压，造模时间持续为12周；2家兔①家兔在表麻下进行眼压测量即可，可采用兔盒固定以便于操作；②TonoVet回弹式眼压计的使用：TonoVet回弹式眼压计适用于兔、猫、犬等，无需手动校准，在测量时将回弹的针头对准家兔角膜中央，并保持眼压计位于水平位置，同时与家兔角膜表面垂直；注意测量过程中若使用兔盒固定应避免卡颈，否则可能会导致眼压升高；其余测量过程同小鼠大鼠；步骤S3：高眼压模型造模成功后取动物眼球观察的房角开放情况、小梁网损伤情况及视网膜损伤情况分别于自首次前房注射后第4周末、第8周末、第12周末各处死一组实验动物后，取眼球进行树脂切片和苏木精-伊红染色HE染色，观察的房角开放情况、小梁网情况及视网膜损伤情况；离体眼球经固定、包埋、切片主要包括房角小梁网切片及视网膜切片、HE染色后，使用光学显微镜进行拍照观察，了解房角开放情况、小梁网损伤情况及视网膜损伤情况；步骤S4：高眼压模型造模成功后评估青光眼性视神经损伤情况：分别于自首次前房注射后第4周末、第8周末、第12周末各选取一组实验动物，对实验动物进行灌注后进行视网膜铺片，对视网膜神经节细胞retinalganglioncells，RGCs进行计数，通过评估RGCs丢失情况来了解该高眼压动物模型中视神经损伤情况，验证是否符合青光眼特征性视网膜损害；步骤S5：设置降眼压对照组，除外高眼压影响因素后评估视网膜损伤情况，以验证IFN-γ单纯对眼压的影响：实验动物眼前房注射IFN-γ同时予以降眼压滴眼液干预，使用0.5％马来酸噻吗洛尔滴眼液，每天使用2次，每次经结膜囊给药1滴，分别选在早上9点和晚上6点，持续使用12周；眼压监测方法及时间点同前3.4，将眼压控制在基础眼压，或眼压波动范围大致同前房注射PBS对照组，排除IFN-γ对视网膜神经节细胞的直接损伤；自首次前房注射IFN-γ同日起予以降眼压药物干预，分别于第4周末、第8周末、第12周末各处死一组实验动物，取眼球进行树脂切片和苏木精-伊红染色HE染色，以及视网膜铺片和RGCs计数方法同前，评估视网膜全层损伤情况和RGCs丢失率，可以与前房注射IFN-γ不予降眼压药物干预组进行对比，得到在排除IFN-γ导致的眼压升高因素后，RGCs丢失率明显降低，视网膜全层未见损伤，以验证IFN-γ单纯对眼压的影响。

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