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申请/专利权人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

摘要：本发明公开了一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒，该试剂盒包括ProbeA、ProbeB、ProbeD、ProbeE、聚合酶、切刻内切酶、辅酶因子、Tris‑HCl、EDTA、TCEP、NaCl、巯基己醇、磷酸缓冲液、dNTPs以及NEBbuffer2.1。本发明提供的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒，构建了可再生的DNA修饰金电极界面，通过茎环结构与哑铃结构DNA在目标核酸与相关酶催化反应下构建的环状DNA结构，能进行电极界面的双足步行反应，可实现目标核酸的超灵敏定量分析，检测限能够达到2.2aM，且具有高选择性特点，能很好的应用于核酸分析检测。

主权项：1.一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测试剂盒，其特征在于，包括ProbeA、ProbeB、ProbeD、ProbeE、聚合酶、切刻内切酶以及辅酶因子；所述聚合酶为Klenowfragment，所述切刻内切酶为Nb.BbvCI，辅酶因子为镁离子；该试剂盒进行核酸检测的方法为：提供单链DNA探针ProbeA以及末端修饰有电信号分子的茎环结构探针ProbeB，ProbeA修饰在电极表面，ProbeB通过Hoogsteen作用结合于ProbeA上从而也修饰在该电极表面；提供茎环结构的探针ProbeE，ProbeE可以被目标核酸打开，并形成一个长茎小环的新型茎环结构，在聚合酶作用下该新型茎环结构与目标核酸发生链置换反应，取代目标核酸，形成的双链DNA拥有切刻内切酶位点，在聚合酶和切刻内切酶的共同酶促反应下产生更多的与目标核酸的序列相同的单链DNA；提供哑铃型探针ProbeD，ProbeD上具有ProbeC序列；与目标核酸的序列相同的单链DNA能够通过杂交反应打开哑铃型探针ProbeD，使ProbeD上游离的5’端与3’端序列通过杂交生成环状DNA，该环状DNA两端的单链区域ProbeC作为双足步行器的walker序列，与修饰于电极表面的ProbeB作用构成DNAzyme结构，在辅酶因子作用下发生切割反应，使得电极的电化学信号强度降低，通过电化学信号强度的变化分析得到目标核酸的浓度；该方法具体包括以下步骤：1金电极表面预处理；2金电极表面核酸修饰：按照以下配方配制电极固定液：Tris-HCl、EDTA、TCEP、NaCl，pH＝7.4；使用电极固定液稀释ProbeA，得到混合液1；将ProbeB使用磷酸缓冲液稀释，得到混合液2；将表面预处理后的金电极插入混合液1中，于室温下反应，随后将金电极冲洗干净后置于巯基己醇中反应；再将金电极插入混合液2中，于室温下反应，得到修饰有ProbeA和ProbeB的金电极；3核酸定量分析：将待测核酸样本使用磷酸缓冲液稀释，然后与ProbeE、Klenowfragment、Nb.BbvCI、dNTPs、NEBbuffer2.1混合，37℃下孵育，然后加热使Klenowfragment、Nb.BbvCI失活，得到混合液3；将混合液3与ProbeD、镁离子充分混合，将得到的溶液滴加到修饰ProbeA和ProbeB的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度；其中，目标核酸的序列为：5’-GTTGGAGCTAGTGGCGTAG-3’；ProbeA的序列为：5’-SH-CH26-TTTTCCTTCCCTTTCCCTCCTCCC-3’；ProbeB的序列为：5’-MB-TTTTATCGACGAAGAAAAGTCCAACCTATrAGGAAGAGATCAGCTTCGTCGATCCCTCCTCCCTTTCCCTTCCAACTAGGAAGGGAAAGGGAGGAGGG-3’；ProbeC的序列为：5’-TCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTT-3’；ProbeD的序列为：5’-TCCAACGGCGTAGTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTCTACGCCACTAGCTCCAACTCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGGTTGTTGGA-3’；ProbeE的序列为：5’-CTACGCCACTAGCTCCAACTCCTCAGCGCGTAGGTACTAAGTTGGAGCTAGTGATCCTACGC-3’。

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百度查询： 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒