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申请/专利权人：吉林省拓华生物科技有限公司

摘要：本发明公开一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法及其应用，该方法包括以下步骤血小板裂解物的提取；胶原蛋白的提取；生物凝胶的生成。本发明的技术方案采用脐血源血小板，其具有低免疫原性和通用性，可以广泛应用，且脐血源血小板裂解物可以实现批量收集、批量制备、批量检测，实现质量可控的生产工艺；通过脐带组织提取得到的胶原蛋白与其它具有免疫原性的蛋白质相比，其免疫原性非常低，且理化性质稳定，具有出色的营养特性与加工性能，在生物医学材料、化妆品、食品、保健品领域均具有广泛应用；通过脐血源血小板制备得到的血小板裂解物和通过脐带组织提取得到的胶原蛋白，用于制备的生物凝胶，降低了生物凝胶的免疫的排斥性。

主权项：1.一种富含胶原蛋白和血小板裂解物的生物凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）血小板裂解物的提取脐带血置于离心管中离心处理，收集血细胞沉淀；加入等体积的羟乙基淀粉注射液，混匀并离心处理，收集上清液，标记为PLT-1，并收集剩余血液；向剩余血液中加入等体积的PBS，混匀，加入淋巴细胞分离液，离心处理；收集PBMC层上面的澄清层于PLT-1中，收集PBMC层于新的离心管中；将PBS加入到PBMC层中，混匀，离心洗涤；收集上层洗液，标记为PLT-2；混匀PLT-1和PLT-2中的血小板，离心处理，收集离心沉淀，加入PBS悬浮处理；反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液；过滤处理，离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液；（2）胶原蛋白的提取从脐带组织中分离出Wharton胶，PBS清洗2遍；加入含胶原酶和透明质酸的消化酶，摇晃反应；加入等体积的胰蛋白酶，摇晃反应；将反应物离心处理，收集上清液；向上清液中加入氯化钠溶液，静置盐析30min后，离心处理，得离心沉淀；加入50%的透明质酸水溶液悬浮离心沉淀，得胶原蛋白；（3）生物凝胶的生成收集悬浮的血小板裂解液和胶原蛋白，并加入8%甘露醇，混匀；冷冻干燥，钴60辐射灭菌，得到生物凝胶；所述脐带血置于离心管中离心处理，收集血细胞沉淀的步骤的离心条件：离心机的转速为2000rpm，离心时间为10min；所述加入等体积的羟乙基淀粉注射液，混匀并离心处理，收集上清液，标记为PLT-1，并收集剩余血液的步骤的离心条件：离心机的离心力为250g，离心时间为20min；所述向剩余血液中加入等体积的PBS，混匀，加入淋巴细胞分离液，离心处理的步骤的离心条件：离心机的离心力为800g，离心时间为20min；所述将PBS加入到PBMC层中，混匀，离心洗涤；收集上层洗液，标记为PLT-2的步骤的离心条件：离心机的离心力为400g，离心时间为10min；所述混匀PLT-1和PLT-2中的血小板，离心处理，收集离心沉淀，加入PBS悬浮处理的步骤的离心条件：离心机的离心力为2000g，离心时间为10min；所述反复冻融处理3次，离心处理，收集上清液的步骤的离心条件：离心机的离心力为2000g，离心时间为10min；所述过滤处理，离心处理，弃上清，加入透明质酸钠水溶液悬浮沉淀，得血小板裂解液的步骤的离心条件：离心机的离心力为12000g，离心时间为20min；所述将反应物离心处理，收集上清液的步骤包括：将反应物置于离心速率为1500rpm的离心机中，离心10min，收集上清液至新的离心管内；所述向上清液中加入氯化钠溶液，静置盐析30min后，离心处理，得离心沉淀的步骤包括：向上清液中加入5molL的氯化钠溶液，静置盐析30min，放置于离心速率为6000rmin的离心机中离心20min。

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