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申请/专利权人：安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院)

摘要：一种确立肝豆状核变性肝纤维化患者肠道菌群结构差异与中医证型相关性的实验方法，首先将WD肝纤维化患者根据中医证型分为湿热内蕴证A、痰瘀互结证B、肝风内动证C、肝肾亏虚证D、脾肾阳虚证E组。取大便样品采用16srRNA测序技术分析，患者组与健康对照组相比肠道菌群丰富度明显降低，证型组之间比较，D、E两组虚证患者菌种含量下降更为显著。门水平菌群结构中，厚壁菌门仍是优势菌门，但证型组含量均有所下降，D、E组下降最为明显，放线菌门结果与之相似，而变形菌门则相反。科水平与属水平结果与门水平相呼应。因此，WD肝纤维化患者与健康对照组肠道菌群在丰度及肠道菌群结构均存在差异，且不同中医证型之间亦存在差异性。

主权项：1.一种确立肝豆状核变性肝纤维化患者肠道菌群结构差异与中医证型相关性的实验方法，其特征在于，包括如下步骤：①证型设计分组：收集五种证型的WD肝纤维化患者，并收集健康志愿者作为对照组；对纳入患者进行辩证分型后，将其分为A湿热内蕴证组、B痰瘀互结证组、C肝风内动证组、D肝肾亏虚证组、E脾肾阳虚证组；连同F健康对照组共计六组人员的性别、年龄、病情程度比较均无明显差异；②样品采集及保存：采集WD肝纤维化组及健康志愿者组成员清晨排出的新鲜粪便，排便到事先准备的容器中，使用无菌采便器选取未受到污染的部分，在无菌环境下封存；对样本进行编号放置于-80℃的恒温冰箱中等待进一步分析；③粪便菌群DNA提取：待所有WD肝纤维化患者及健康志愿者样本收齐后，选用DNA提取试剂盒提取样本总DNA，运用Nanodrop技术对样本DNA进行定量分析，最后使用琼脂糖凝胶电泳检测技术对提取的DNA质量进行分析；④PCR扩增：在进行PCR扩增的过程中，高度把控扩增的循环数，再循环数能保持在最低范围内，同时所有样本的扩增条件需要是相同的；在进行扩增时，设立阴性对照组；⑤扩增产物磁珠纯化回收、测序文库制备：通过磁珠筛选去除接头自连片段，纯化添加接头后的文库体系；对处理过的DNA片段进行PCR扩增，并采用BECKMANAMPureXPBeads再次纯化文库富集产物；最后运用2％琼脂糖凝胶电泳技术，对测序文库进行最后的片段处理；⑥统计学分析：采用SPSS26.0统计软件进行统计学分析，完全随机的无序分类变量资料进行相关及差异性分析采用X2检验。

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