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申请/专利权人:江苏省农业科学院
摘要:本发明公开了呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法,优化了构建呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型的条件,包括DON的浓度和处理细胞的时间,将对进一步研究DON对猪繁殖毒性和病理研究提供非常重要的实验材料和技术方法。
主权项:1.呕吐毒素诱导猪胎盘滋养层细胞损伤的细胞模型构建方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、将pTr细胞接种至96孔板,更换培养基,加入DON诱导细胞,浓度设定为:0、0.5μgmL、1μgmL和2μgmL;时间设定为:24h、48h和72h后;处理结束后每孔加入10μL的CCK-8溶液,在37℃下恒温孵育2h,用酶标仪检测在450nm处的吸光度值,计算细胞存活率,筛选出抑制pTr细胞活力的DON浓度剂量和诱导时间;步骤二、将pTr细胞接种至12孔板,加入DON诱导细胞,浓度设定为:0、0.5μgmL、1μgmL和2μgmL;时间设定为:24h、48h和72h,处理结束后收集细胞总RNA,反转录成cDNA;利用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达水平,以GAPDH的表达作为内参来标准化基因表达水平,筛选出引起pTr细胞增殖抑制、氧化应激和迁移抑制的DON浓度剂量和诱导时间;步骤三、利用步骤二中12孔板培养pTr细胞,待细胞密度达90%后,用10μL枪头垂直于培养板底面画线制造划痕,分别在0h、24h、48h和72h处统计各组细胞的划痕宽度,验证pTr细胞在不同DOD浓度下细胞的迁移能力的差异,得到DON诱导pTr细胞损伤的细胞模型。
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