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申请/专利权人：康诺生物制药股份有限公司

摘要：本发明公开了一种基于泛酸激酶工程菌的辅酶A制备方法，涉及生物医药技术领域，辅酶A的制备方法如下：步骤S1、培养解淀粉芽孢杆菌，并从解淀粉芽孢杆菌中分离得到泛酸激酶基因，步骤S2、根据步骤S1中得到泛酸激酶基因，再从GenBank数据库中找到相应的泛酸激酶核苷酸序列，并将其克隆至大肠杆菌表达载体pET‑28a+上，获得重组质粒pET‑28a‑PANK，步骤S3、将步骤S2得到的重组质粒pET‑28a‑PANK转入大肠杆菌BL21DE3中。本发明将泛酸激酶从解淀粉芽孢杆菌中提取分离出来，并将泛酸激酶的基因应用到产氨短杆菌生产辅酶A中，由于来源于解淀粉芽孢杆菌的泛酸激酶基因的过表达不会造成反馈抑制，因此有利于大幅度提高产氨短杆菌生产辅酶A的产量。

主权项：1.一种基于泛酸激酶工程菌的辅酶A制备方法，其特征在于，辅酶A的制备方法如下：步骤S1、培养解淀粉芽孢杆菌，并从解淀粉芽孢杆菌中分离得到泛酸激酶基因；步骤S2、根据步骤S1中得到泛酸激酶基因，再从GenBank数据库中找到相应的泛酸激酶核苷酸序列，并将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a+上，获得重组质粒pET-28a-PANK；步骤S3、将步骤S2得到的重组质粒pET-28a-PANK转入大肠杆菌BL21DE3中，并对其进行诱导表达得到重组蛋白Pank；步骤S4、建立重组蛋白Pank与产氨短杆菌联合酶促转化体系；步骤S5、对辅酶A的产量进行测定；在步骤S1中，还包括如下步骤：步骤S11、菌株培养：将具有生产泛酸激酶能力的解淀粉芽孢杆菌菌株放在培养基中进行培养，其培养温度为29℃，PH值为6.5-7.0，培养25～30h；步骤S12、发酵过程：向培养基中添加营养物质和诱导剂，使解淀粉芽孢杆菌在有氧条件下进行发酵，以生成代谢产物；步骤S13、提取与分离：发酵结束后，收集发酵后的解淀粉芽孢杆菌的菌体，并通过化学破碎法来破坏细胞膜，释放出细胞内的物质，然后通过离心和过滤法去除未破碎的细胞和大的细胞碎片，将泛酸激酶从其他细胞组分中分离出来，得到提取液；步骤S14、纯化：使用色谱技术对步骤S13中的提取液进行高精度的纯化，以获得高纯度的泛酸激酶；步骤S15、结构鉴定：利用核磁共振技术和质谱分析技术对步骤S14中的高纯度的泛酸激酶进行结构鉴定，得到泛酸激酶基因；步骤S16、功能性验证：通过生物学实验验证所提取的泛酸激酶的活性。

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