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申请/专利权人：天津科技大学

摘要：本发明公开一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coliUR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrHD90A；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrGE156K；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD。本发明工程菌解除了UMP和CTP对胞苷合成途径关键酶的反馈调节，增加了胞苷合成的代谢通量。

主权项：1.一株无质粒、以葡萄糖廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌，其特征在于：所述胞苷基因工程菌是在尿苷基因工程菌E.coliUR11的基础上，缺失了胞苷脱氨酶Cdd；缺失了嘧啶单磷酸核苷酶YgdH；缺失了胞苷酸激酶CmK；缺失了核苷三磷酸焦磷酸水解酶YhdE和MazG；过表达内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶NudG；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶PyrHD90A；过表达枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶PyrGE156K；缺失了核苷三磷酸还原酶NrdD；其中，所述Cdd的基因序列为SEQIDNO.1，YgdH的基因序列为SEQIDNO.2，CmK的基因序列为SEQIDNO.3，YhdE的基因序列为SEQIDNO.4，MazG的基因序列为SEQIDNO.5，NudG的基因序列为SEQIDNO.6，PyrHD90A的基因序列为SEQIDNO.7，PyrGE156K的基因序列为SEQIDNO.9，NrdD的基因序列为SEQIDNO.11；所述尿苷基因工程菌E.coliUR11是在E.coliW3110的基因组上整合了来源于B.subtilisA260的嘧啶核苷操纵子PyrBCAKDFE，由强启动子Ptrc控制；敲除尿苷激酶基因udk、尿苷磷酸化酶基因udp和核苷水解酶基因rihA、rihB和rihC；在基因组上对其自身PRPP合成酶基因prsA进行双拷贝，由强启动子Ptrc启动；敲除高丝氨酸脱氢酶基因thrA；敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因argF；如上所述的胞苷的基因工程菌的构建方法，所述方法是采用CRISPRCas9介导的基因编辑技术对E.coliUR11基因组进行定向改造；步骤如下：（1）敲除胞苷脱氨酶基因cdd，cdd基因序列为SEQIDNO.1；（2）敲除嘧啶单磷酸核苷酶基因ygdH，ygdH基因序列为SEQIDNO.2；（3）敲除胞苷酸激酶基因cmK，cmK基因序列为SEQIDNO.3；（3）敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因yhdE，yhdE基因序列为SEQIDNO.4；（4）敲除核苷三磷酸焦磷酸酶基因mazG，mazG基因序列为SEQIDNO.5；（5）在假基因位点yeeP、mbhA、yjiT分别整合大肠杆菌内源的核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nudG，nudG基因序列为SEQIDNO.6，由强启动子Ptrc控制；（6）在胞苷脱氨酶基因位点cdd和假基因位点yghE分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的尿苷酸激酶基因pyrHD90A，cdd基因序列为SEQIDNO.1，pyrHD90A基因序列为SEQIDNO.7，由强启动子Ptrc控制，尿苷酸激酶氨基酸序列为SEQIDNO.8；（7）在胞苷酸激酶基因位点cmK、假基因位点ilvG分别整合枯草芽孢杆菌来源的携带突变点的胞苷三磷酸合酶基因pyrGE156K，cmK基因序列为SEQIDNO.3，pyrGE156K基因序列为SEQIDNO.9，由强启动子Ptrc控制，胞苷三磷酸合酶氨基酸序列为SEQIDNO.10；（8）敲除核苷三磷酸还原酶基因nrdD，nrdD基因序列为SEQIDNO.11；所述强启动子Ptrc的基因序列为SEQIDNO.12；所述Ptrc终止子的基因序列为SEQIDNO.13。

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百度查询： 天津科技大学 一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成胞苷的基因工程菌、方法和应用