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申请/专利权人：黑龙江大学

摘要：黄芩茎叶多糖的提取纯化方法及其应用，涉及一种黄芩茎叶多糖的提取纯化方法及其应用。本发明是为了解决黄芩作为中药材只使用根，造成大量的黄芩茎叶部分被遗弃造成药用资源浪费。本方法经过黄芩茎叶多糖提取、Sevag法脱蛋白、DEAE‑52离子交换柱层析和葡聚糖凝胶G‑200柱层析纯化，即得黄芩茎叶多糖。黄芩茎叶多糖以浓度依赖性的方式促进RAW264.7细胞的增殖，并且提高RAW264.7细胞的吞噬能力。本发明首次从黄芩茎叶中提取并纯化得到了具有免疫调节活性功能的黄芩茎叶多糖，并完成了对黄芩茎叶多糖的部分结构鉴定，解决了大量的黄芩茎叶部分被遗弃造成了药用资源的浪费的问题。本发明属于中药有效成分提取的技术领域。

主权项：1.黄芩茎叶多糖的提取纯化方法，其特征在于所述黄芩茎叶多糖的提取纯化方法如下：一、黄芩茎叶多糖提取：将黄芩茎叶晒干粉碎，过60目筛，将细粉用10倍体积的无水乙醇进行回流脱脂2次，一次2h，脱脂后的药粉自然晾干，每次称取3kg脱脂后黄芩茎叶药粉，在料液比1g:20mL-1g:30mL、温度80℃-100℃、提取时间3h-5h的条件下提取2次，合并水提液后浓缩，加入无水乙醇至乙醇体积分数为80％，沉淀过夜后在4000rpm条件下离心5min，收集沉淀，自然风干后得到粗多糖；二、Sevage法脱蛋白：将氯仿、正丁醇按照体积比为4:1的混合，得到Sevage溶液，将步骤一得到的粗多糖与Sevage溶液按照体积比为4:1混合，剧烈搅拌30min后4000rpm离心10min，除去游离的蛋白质，反复多次，直至无明显蛋白产生为止，将脱蛋白后的多糖溶液真空旋蒸，用质量分数为4.5％H2O2进行脱色，脱色时间为100min，脱色温度为60℃，之后进行冷冻干燥，得到样品多糖；三、DEAE-52离子交换柱层析：1DEAE-52纤维素预处理取100gDEAE-52纤维素，用10倍体积的ddH2O浸泡24h，待其充分溶胀后，真空抽滤去除水分，使用0.05molLNaOH浸泡1h，水洗至中性，再采用0.1molLHCl浸泡30min，水洗至中性，最后用0.1molLNaOH处理30min，水洗至中性，将填料与水按照2:1的质量比混合，充分搅拌，制成填料匀浆，准备装柱；2装柱将层析柱垂直固定于铁架台上，将填料匀浆缓慢倒入柱床，同时搅拌，防止气泡产生；装填完成后选择超纯水为流动相进行压柱，隔夜静置，使填料面稳定；3上样取2g样品多糖，溶于超纯水中，配制为100mgmL的多糖溶液，过0.45μm滤膜后，缓慢倒入柱中，连接蠕动泵，准备洗脱；4洗脱依次选用超纯水、0.1molL、0.3molL、0.5molL、1molL的NaCl溶液进行梯度洗脱，控制流速1mLmin，自动收集器每5mL收集一管；5糖含量检测采用苯酚-硫酸法对每管中洗脱液的糖含量进行检测，从每个收集管中吸取200μL洗脱液，分别加入200μL质量分数6％的苯酚溶液与1mL浓硫酸，振荡混匀后静置20min，用酶标仪测定490nm处各管的吸光值，并根据吸光值绘制洗脱曲线；根据洗脱结果合并相同的馏分，并在截留分子量为3.5×103Da透析袋中透析72h，冷冻干燥，得到组分SSP-3；四、葡聚糖凝胶G-200柱层析：1SephadexG-200凝胶预处理将SephadexG-200凝胶用10倍体积超纯水浸泡24h，使凝胶充分膨胀，清洗后搅拌均匀，制备成凝胶匀浆；2装柱将层析柱垂直固定于铁架台上，将填料匀浆缓慢倒入柱床，同时搅拌，防止气泡产生；装填完成后选择超纯水为流动相进行压柱，隔夜静置，使填料面稳定；3上样取200mg步骤三中得到的组分SSP-3，配制成质量分数为5％溶液，过0.45μm滤膜后缓慢倒入柱中，准备洗脱；4洗脱超纯水作为流动相，控制流速为15mLh，设置自动收集器每5min收集1管；5糖含量检测采用苯酚-硫酸法对每管中洗脱液的糖含量进行检测，从每个收集管中吸取200μL洗脱液，分别加入200μL质量分数6％的苯酚溶液与1mL浓硫酸，振荡混匀后静置20min，用酶标仪测定490nm处各管的吸光值，并根据吸光值绘制洗脱曲线；根据洗脱结果合并相同的馏分，并在截留分子量为3.5×103Da透析袋中透析72h，冷冻干燥，得到黄芩茎叶多糖SSP-3a。

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