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申请/专利权人：王锦堂;周美吟

摘要：本发明提供了各种克雷伯氏肺炎杆菌的免疫原，其包含具有选自本发明所述的式I至VI的结构式的克雷伯氏肺炎杆菌荚膜多糖的糖类的重复单元。本发明还提供了包含一种或多种选自式I至VI的免疫原的疫苗以及一种可引发针对克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae）的免疫反应并通过使用本发明的免疫原来预防克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae）感染的方法。

主权项：1.一种克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖的疫苗，包含：免疫原I，包含具有下式I的克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖的三糖的重复单元： 载体；其特征在于，m为1至4，并且所述免疫原I是分解的荚膜多糖-硫醇。

全文数据：克雷伯氏肺炎杆菌的荚膜多糖疫苗相关申请的交叉引用本申请主张2016年10月3日提交的美国临时专利申请号62403,365的优先权，并且还主张2016年10月26日提交的美国临时专利申请号62413,269的优先权。上述申请通过引用并入本文。技术领域本发明涉及疫苗领域。具体地，本发明涉及一种抗克雷伯氏肺炎杆菌感染的疫苗，其包含克雷伯氏肺炎杆菌的荚膜多糖寡糖单元的接合物。背景技术克雷伯氏肺炎杆菌是一种引起人体各种疾病的重要病原体。最近，由克雷伯氏肺炎杆菌引起的社区获得性细菌性肝脓疡PLA已经成为一种全球性的疾病。在患有克雷伯氏肺炎杆菌的细菌性肝脓疡PLA中，死亡率为10％，而在具有转移性脑膜炎的细菌性肝脓疡PLA中，死亡率则提高为30-40％。转移性脑膜炎的存活者通常具有严重的神经学后遗症，而转移性眼内炎通常会影响眼睛导致眼盲。除了引起细菌性肝脓疡PLA之外，克雷伯氏肺炎杆菌也已经被证实会引起侵入性感染，导致在其它部位的脓疡例如肾、脾、脑、前列腺，坏死性筋膜炎和严重的菌血症肺炎。研究报告指出，引起PLA的菌株最常见的荚膜类型为K1，第二为K2。除了这些对细菌性肝脓疡PLA的研究外，最近的研究也指出，克雷伯氏肺炎杆菌的K1及K2荚膜类型也会引起其他如坏死性筋膜炎及社区获得性菌血症肺炎的侵入性感染LinYTetal.,BMCinfectiousdiseases2010,10:307；andFangCTetal.,Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica2007,453:284-293。此外，克雷伯氏肺炎杆菌也造成了大约10％的院内感染并且对广谱β-内酰胺类和碳青霉烯类等抗生素抗药性的提高也是显著的问题。我们最近的研究指出，荚膜类型K6438％，K6213％，K248％，KN27％和K286％占抗碳青霉烯类抗生素的克雷伯氏肺炎杆菌菌株Carbapenem-ResistantKlebsiellapneumoniae；CRKP中的72％，在研究中可以观察到CRKP的荚膜类型有集中的现象。针对细菌荚膜为设计目标的疫苗，例如用于肺炎链球菌的疫苗，通常可以有效对抗由这类具有荚膜的病原体所引起的感染。在1985年曾公开了一种克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖CPS疫苗。在1988年有一发明公开了一种克雷伯氏肺炎杆菌24价的荚膜多糖荚膜多糖CPS疫苗。虽然多年前就曾公开了克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖CPS和24价荚膜多糖CPS疫苗，但直到目前为止，仍然没有可用的克雷伯氏肺炎杆菌疫苗。先前的研究表明多糖疫苗仅能诱导缺乏免疫记忆的T细胞的独立免疫以及缺乏高亲和性抗体的产生。因此，一种克雷伯氏肺炎杆菌荚膜多糖CPS-蛋白质接合疫苗可以更有效对抗由该细菌所引起的感染。过去的研究指出，K1和K2荚膜多糖CPS是由几个糖重复单元所组成的巨大分子YangFLetal.,TheJournalofbiologicalchemistry2011,28624:21041-21051。荚膜多糖CPS的解聚将提高与蛋白质偶联的效率。而一些化学试剂，如三氟乙酸、氢氧化铵和乙酸，虽然会降解荚膜多糖CPS，却导致对于免疫反应非常重要的荚膜多糖CPS修饰乙酰化或丙酮化的丧失。WO20125676A1提供了一种分离的噬菌体，该噬菌体可感染K1克雷伯氏肺炎杆菌菌株并且具有一种专门分解K1荚膜多糖CPS的荚膜解聚酶。可利用此酶开发一种可有效对抗克雷伯氏肺炎杆菌感染的疫苗。发明概述本发明利用与载体分别接合的克雷伯氏肺炎杆菌的分解荚膜多醣CPS以产生的荚膜多醣CPS接合疫苗。令人惊讶地，本发明的荚膜多糖CPS接合疫苗亦可同时诱导具有杀菌活性的荚膜多糖CPS抗体。故，本发明的荚膜多糖CPS接合疫苗可用于预防克雷伯氏肺炎杆菌造成的侵入性感染。本发明提供了包含选自如本文所述的式I至VI的克雷伯氏肺炎杆菌荚膜多糖CPS的重复单元的各种免疫原。本发明提供了一种分离出的多肽，其具有专一于克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiellapneumoniae荚膜型K2菌株的荚膜的降解活性，其是选自：a包含氨基酸序列SEQIDNO：2；和b一种多核苷酸编码的多肽，其为至少在高严格条件下与iSEQIDNO:2的多肽编码序列，或iii的全长互补链杂交的多核苷酸。本发明还提供了包含一种或多种选自式I至VI的免疫原的疫苗。某些实施方式包括含有与蛋白质载体接合的免疫原的疫苗。在进一步的实施方式中，该疫苗是K1和K2荚膜多糖CPS接合的二价疫苗，其包含式I和式II的免疫原，或包含式III和式IV的免疫原的K64和K62荚膜多糖CPS接合二价疫苗。本发明提供了引发针对克雷伯氏肺炎杆菌的免疫反应的方法，包括施用有效量的本发明的免疫原或本发明的疫苗。本发明还提供了通过施用本发明的接合疫苗制备的抗体。本发明还提供了预防克雷伯氏肺炎杆菌感染的方法，包括施用有效量的本发明的免疫原或本发明的疫苗。附图说明图1A到C显示纯化K2-ORF16蛋白的酶活性。A纯化的K2-ORF16蛋白以箭头表示以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳SDS-PAGE分离，并利用考马斯蓝染色，其蛋白质大小千道尔顿标记在蛋白标准旁边；B当噬菌体1611E-K2-1左及其K2-ORF16蛋白右分别点在含有克雷伯氏肺炎杆菌K.pneumoniae1611E菌株的一覆盖顶层琼脂的多孔盘上时，可观察到具有半透明晕和半透明斑点的清晰斑点；C以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳SDS-PAGE分离以不同量的K2-ORF16蛋白处理的经萃取的K2荚膜多糖CPS并以阿尔新蓝染色。图2A到D显示以K1-ORF34蛋白分解的K1荚膜多糖CPS的质量和毛细管电泳分析。A经K1-ORF34裂解的K1荚膜多糖CPS的质量分布并以Bio-GelP-6GelBIO-RAD#1504130胶体管柱分离；B经K1-ORF34裂解的K1荚膜多糖CPS的毛细管电泳；CK1荚膜多糖CPS片段分子量：1,145的串连质谱分析；DK1寡糖核磁共振氢谱。图3A到C显示经K2-ORF16蛋白分解的K2荚膜多糖CPS的结构分析。AK2-ORF16蛋白分解的K2荚膜多糖CPS的基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱MALDI-TOF分析；B质荷比mz为703的电喷洒游离质谱-质谱联用分析；以及C质荷比mz为1365的电喷洒游离质谱-质谱联用分析。图4显示了经K62荚膜解聚酶分解的K62荚膜多糖CPS的主要产物结构的串连质谱分析。图5A到C显示了K1荚膜多糖CPS接合疫苗的安全性。A记录每次免疫接种K1荚膜多糖CPS接合疫苗前一天和后一天的小鼠的体重。B记录每次免疫接种K1荚膜多糖CPS接合疫苗前一天和后一天的小鼠的体温。C测定每次免疫接种K1荚膜多糖CPS接合疫苗后一周的小鼠的肝血清转氨酶ALT和肾血尿素氮BUN和肌酸酐功能。图6显示了接种K1或K2或K62荚膜多糖CPS接合疫苗后的小鼠，其会诱导出对抗荚膜多糖CPS的抗体。将不同量的K1或K22000纳克至7.8125纳克，2倍稀释或K62荚膜多糖CPS4000纳克至500纳克，2倍稀释转移到膜上，并以从接种K1或K2或K62荚膜多糖CPS接合疫苗的小鼠中获得的血清1∶1000稀释用来做印迹分析。图7A到C显示了K1或K2或K62荚膜多糖CPS接合疫苗在小鼠体内的功效。五只经K1或K2荚膜多糖CPS接合疫苗免疫的小鼠，分别以腹腔注射接种1×104菌落形成单位CFU，colony-formingunit的克雷伯氏肺炎杆菌NTUH-K2044A或NTUH-A4528。接种K1或K2荚膜多糖CPS接合疫苗显著增加了感染克雷伯氏肺炎杆菌NTUH-K2044P＝0.0144，对数等级检定log-ranktest或NTUH-A4528P＝0.0023，对数等级检定log-ranktest的小鼠的存活率。以5×106菌落形成单位CFU，colony-formingunit的K62克雷伯氏肺炎杆菌C攻击五只接种K62荚膜多糖CPS接合疫苗并用环磷酰胺处理以诱导嗜中性细胞减少症的小鼠。K62荚膜多糖CPS接合疫苗显著保护免疫受损的小鼠免于K62克雷伯氏肺炎杆菌的感染P＝0.0448，对数等级检定log-ranktest。图8A和B显示了K1和K2荚膜多糖CPS接合二价疫苗在小鼠中的功效。经K1和K2荚膜多糖CPS接合二价疫苗免疫的五只小鼠分别以腹腔注射接种1×104菌落形成单位CFU，colony-formingunit的克雷伯氏肺炎杆菌NTUH-K2044A或NTUH-A4528B。接种K1或K2荚膜多糖CPS接合疫苗显著增加了感染克雷伯氏肺炎杆菌NTUH-K2044P＝0.0143，对数等级检定log-ranktest或NTUH-A4528P＝0.0023，对数等级检定log-ranktest的小鼠的存活率。图9至12分别显示K64荚膜多糖CPS，K24荚膜多糖CPS，K28荚膜多糖CPS和KN2荚膜多糖CPS的光谱。图13A和B显示以未经加工的K1荚膜多糖CPS或K1荚膜多糖CPS接合疫苗接种的小鼠，诱导出抗K1荚膜多糖CPSA和血清杀菌活性B的抗体。将不同量的K12000纳克至7.8125纳克，两倍稀释转移到膜上，并以未经加工的K1荚膜多糖CPS或K1荚膜多糖CPS接合疫苗接种的小鼠中获得的血清1∶1000稀释用来做印迹分析。发明内容除非另有说明，否则本文是根据常规用法使用技术术语。除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“一”、“一个”和“该”皆包括复数指代物。同样地，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。本文所使用的缩写：GlcAp：葡萄糖醛酸；Fucp：岩藻糖；Glcp：葡萄糖；Manp：甘露糖；Rhap：鼠李糖；Galp：半乳糖；GlcUAp：GlcAp：葡萄糖醛酸。本文所用的术语“接合物”是指由连接在一起的两个异源分子组成的组合物，其用于刺激或引发动物中的特异性免疫反应。在一些实施方式中，该免疫反应是指保护性的，其直接使动物更有效地对抗该免疫原性接合物所针对的生物体的感染。该免疫原性接合物的具体实施方式是指疫苗，例如接合疫苗。本文所用的术语“连接物”是指用于可操作地连接两个不同分子的分子桥的化合物或部分，其中连接物的一端可操作地连接至第一分子，另一端则可操作地连接至第二分子。两种不同的分子能以逐步的方式连接到连接物上。本文所用的术语“疫苗”是指能在对象中引起预防性或治疗性免疫反应的药物组合物。通常，疫苗会引起对病原体抗原的抗原专一性免疫反应。本文所用的术语“寡糖”是指含有两个或更多个单糖单元的化合物。寡糖被认为具有还原性末端和非还原性末端。本文所用的术语“蛋白质载体”是指与寡糖偶联或接合的蛋白质、肽或其片段，其可比单独的寡糖更高程度地加强所得寡糖-蛋白质载体接合物的免疫原性。本文所用的术语“抗体”涵盖多克隆和单克隆抗体制剂，亦包括杂交抗体、改变的抗体，Fab'.sup.2片段、Fab分子、Fv片段、在噬菌体上分布的单链片段变体scFv、单结构域抗体、嵌合抗体、人源化抗体及其显示亲本抗体分子的免疫结合特性的功能片段。本文所用的术语“免疫原”是指能够在哺乳动物中诱导免疫反应的蛋白质或其部分，例如已感染或有感染病原体风险的哺乳动物。免疫原的施用可诱导出针对感兴趣病原体的保护性免疫和或主动免疫。一方面，本发明提供了包含具有下式I的克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖CPS的三糖的重复单元的免疫原：{→4-[2，3-S-pyruvate]-b-D-GlcAp-1→4-a-L-O-Ac-Fucp-1→3-b-D-Glcp-1→}mI其中m为1至4。在一具体实施方式中，m为2。本发明发现K1-ORF34多肽可以降解克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖CPS。降解后，可以获得克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖CPS的六糖。从K1荚膜多糖CPS降解的六糖可被用为针对克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiellapneumoniae感染的免疫原。K1-ORF34多肽具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。MALIRLVAPERVFSDLASMVAYPNFQVQDKITLLGSAGGDFTFTTTASVVDNGTVFAVPGGYLLRKFVGPAYSSWFSNWTGIVTFMSAPNRHLVVDTVLQATSVLNIKSNSTLEFTDTGRILPDAAVARQVLNITGSAPSVFVPLAADAAAGSKVITVAAGALSAVKGTYLYLRSNKLCDGGPNTYGVKISQIRKVVGVSTSGGVTSIRLDKALHYNYYLSDAAEVGIPTMVENVTLVSPYINEFGYDDLNRFFTSGISANFAADLHIQDGVIIGNKRPGASDIEGRSAIKFNNCVDSTVKGTCFYNIGWYGVEVLGCSEDTEVHDIHAMDVRHAISLNWQSTADGDKWGEPIEFLGVNCEAYSTTQAGFDTHDIGKRVKFVRCVSYDSADDGFQARTNGVEYLNCRAYRAAMDGFASNTGVAFPIYRECLAYDNVRSGFNCSYGGGYVYDCEAHGSQNGVRINGGRVKGGRYTRNSSSHIFVTKDVAETAQTSLEIDGVSMRYDGTGRAVYFHGTVGIDPTLVSMSNNDMTGHGLFWALLSGYTVQPTPPRMSRNLLDDTGIRGVATLVAGEATVNARVRGNFGSVANSFKWVSEVKLTRLTFPSSAGALTVTSVAQNQDVPTPNPDLNSFVIRSSNAADVSQVAWEVYLSEQIDNO:1在另一方面，本发明提供了一种免疫原，其包含克雷伯氏肺炎杆菌K2荚膜多糖CPS的四糖的重复单元，具有下式II：其中n为1至4。在一具体实施方式中，免疫原包含一个重复单元即，n为1。本发明发现K2-ORF16多肽可降解克雷伯氏肺炎杆菌K2荚膜多糖CPS。降解后，可得到克雷伯氏肺炎杆菌K2荚膜多糖CPS的四糖。K2荚膜多糖CPS降解后产生的四糖可以用作对抗克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiellapneumoniae感染的免疫原。因此，本发明提供了分离的多肽或其变体，其具有专一于克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiellapneumoniae荚膜型K2菌株的荚膜的降解活性，所述K2型菌株选自：a包含氨基酸序列SEQIDNO：2；和B一种多核苷酸编码的多肽，其为至少在高严格条件下与iSEQIDNO:2的多肽编码序列，或iii的全长互补链杂交的多核苷酸。在一具体实施方式中，所述K2-ORF16多肽具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。MTIIKRADLGRPLTWDELDDNFQQVDDLTAAASAAVLSASASATAAAGSATNSLNSANSAASSADDAAASATVAINALMNSTFEPADFDFTSGGTLDSTDRNKAVYNPADNNWYSWSGILPKIVTAATDPTADSNWKPRTDQLLRQNLASSVIPGTSLVTHSDGIHLDDYIEIFNRRTKFIMPEDFPGTDTEQLQSALSYAKSNRVNVVLQAGKTYYVTGSQGLEVDLGYYSFESPNGIAYIDFTGCTATYCLWVHSSRPYPDGSENHCTSMRGIKFKSSVKGIGQRLLLTGNNNDSSNGTYNGDCKIENCMFSTADIVLGASNSTWRYKFINCGFMMESTGGTYAMHFPAGISDSGESVTFQNCKIFDMKGCPILVECASFAIGMPGTSVLNTPIKITGSGAMVIMDSAANIENPGASAWYRYGEVTGTGARLILNGCTLVCNNPSLQTKPLFYVGANAFIDVTLVKTPGNDYLFQNGDEGLRTFVEGDGYVTASHCIGDILSGVGNIPLHKSLNPTLNPGFETGDLSSWSFNNQGSASQTCVVGTAYKKTGTYGARMTSFGSLSCFLTQKVKVTQHGYYSTTCQINTITAGTGTTAGSLTITFYNRDGNALQAGASSNFTNTPSGWQSVGRFIQGRVPQAAEYCEVSFRCREGAVIDVDNFIINFTSEQIDNO:2该多肽的变体是人造的，其包含SEQIDNO：2的多肽的一个或多个氨基酸的取代、缺失和或插入。优选地，氨基酸改变具有较小的影响，即具保守性的氨基酸序列的取代或插入不显著影响蛋白质的折叠和或活性，其通常为1至约30个氨基酸的小缺失、小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸的残基、最多约20至25个残基的小连接肽或通过改变净电荷或其他功能，如组氨酸标签、多聚组氨酸卷标区域、抗原决定位或结合结构域。另一方面，本发明提供了一种免疫原，其包括克雷伯氏肺炎杆菌K64荚膜多糖CPS的六糖的重复单元，具有下式III：其中n为1至4。在一具体实施方式中，n为1。在另一方面，本发明提供了一种免疫原，其包括克雷伯氏肺炎杆菌K62荚膜多糖CPS的五糖的重复单元，具有下式IV：其中n是1至4。在一具体实施方式中，n为2。在另一方面，本发明提供了一种免疫原，其包括克雷伯氏肺炎杆菌K24荚膜多糖CPS的五糖的重复单元，具有下式V：其中n是1至4。在一具体实施方式中，n为1。在另一方面，本发明提供了一种免疫原，其包括克雷伯氏肺炎杆菌K28荚膜多糖CPS的六糖的重复单元，具有下式VI：其中n为1至4，n为1。在另一方面，本发明提供了一种免疫原，所述免疫原包括克雷伯氏肺炎杆菌KN2荚膜多糖CPS的六糖的重复单元，其具有四个六糖和一个己糖醛酸，其分子量约为1027。WO20125676A1描述了用于降解K24、K28、K62、K64和KN2的荚膜多糖CPS的酶。在另一方面，本发明提供了包含一种或多种选自式I至VI的免疫原的疫苗。K1、K2、K62、K64、K24和K28的结构糖单元和降解的荚膜多糖CPS产物如下。在一具体实施方式中，免疫原与蛋白质载体互相接合。在一具体实施方式中，本发明的疫苗是多价疫苗。在一些具体实施方式中，疫苗包含式I和式II的免疫原的K1和K2荚膜多糖CPS接合二价疫苗。在另一个实施方式中，该疫苗包含免疫原I-载体和免疫原II-载体混合物的K1和K2荚膜多糖CPS接合的二价疫苗，其中具有式I的免疫原I和具有式II的免疫原II分别接合至载体。在一具体实施方式中，疫苗是多价疫苗。在一些具体实施方式中，所述疫苗包含式III和式IV的免疫原的K64和K62荚膜多糖CPS接合二价疫苗。在另一具体实施方式中，所述疫苗是K64和K62荚膜多糖CPS接合二价疫苗，包括免疫原III-载体和免疫原IV-载体的混合物，其中，具有式III的免疫原III和具有式IV的免疫原IV分别与载体接合。本发明的免疫原可以与载体接合形成接合物。在一具体实施方式中，接合物是疫苗。在另一具体实施方式中，接合疫苗中的任何一种免疫原比为1：1.4至1：10.2。在一具体实施方式中，所述疫苗包含10％重量百分比至90％重量百分比的免疫原I-蛋白质载体或免疫原III-蛋白载体及10％重量百分比至90％重量百分比的免疫原II-蛋白质载体或免疫原IV-蛋白质载体。疫苗优选包含等量的免疫原I-蛋白质载体或免疫原III-蛋白质载体及免疫原II-蛋白质载体或免疫原IV-蛋白质载体。合适的载体在本领域中为习知技术，并且可以包括例如蛋白质、肽、脂质、聚合物、树枝状大分子、病毒体、类病毒颗粒VLP或其组合。在一具体实施方式中，载体是蛋白质载体，包括但不限于细菌类毒素、毒素、外毒素和其无毒衍生物，如钥孔虫戚血蓝蛋白KLH、B型肝炎病毒核心蛋白、甲状腺球蛋白、白蛋白例如牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HSA和卵清蛋白、肺炎球菌表面蛋白APspA、肺炎球菌粘附蛋白PsaA、结核菌素纯化蛋白衍生物PPD；运铁蛋白结合蛋白、聚氨基酸、破伤风类毒素、破伤风毒素片段C，白喉类毒素，CRM无毒白喉毒素突变体，霍乱毒素，金黄色葡萄球菌外毒素或类毒素，大肠杆菌热不稳定性肠毒素，铜绿假单胞菌外毒素A和细菌外膜蛋白如脑膜炎奈瑟氏菌血清型B外膜蛋白复合物OMPC和外膜3类孔蛋白rPorB。在一具体实施方式中，载体是蛋白质载体。在另一具体实施方式中，所述蛋白质载体是CRM197。CRM197的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSSEQIDNO:3多糖含有羟基，偶尔会含有羧基和氨基，而蛋白质含有氨基和羧基。本领域已知许多将蛋白质与多糖接合的方法。若蛋白质载体具有两种或更多种相同的糖类，则糖可以与蛋白质载体的相同分子接合。或者，所述糖类可以分别与蛋白质载体的不同分子每个蛋白质载体分子仅具有一种与其结合的糖类分子偶联。根据本领域普通技术人员在制药和兽医领域中熟知的标准技术，考虑如特定抗原、佐剂如果有、特定动物或患者的年龄、性别、体重、种类和状况以及给药途径等因素，可以确定待施用至人或动物的本发明所述的疫苗的用量及给药的方法。本发明所述的接合疫苗能以与用于治疗或预防的常规方法学一致的方法递送至对象，例如用于治疗或预防来自克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiellapneumoniae感染的方法。本发明公开了在足以预防、抑制和或改善克雷伯氏肺炎杆菌感染的条件下，将可达预防或治疗的有效剂量的接合疫苗和或其它生物活性剂施用于需要这种治疗的对象一段时间。在一些实施方式中，对象接种本发明的接合疫苗后，成功引起对象体内针对克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiellapneumoniae抗原性免疫原的免疫反应。在一些实施方式中，该接受治疗的对象是选自已感染克雷伯氏肺炎杆菌或具有发展克雷伯氏肺炎杆菌感染风险的对象，例如已暴露或有可能暴露于克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiellapneumoniae环境下的对象。在一重要方面，本发明提供的接合疫苗可以用于预防克雷伯氏肺炎杆菌的感染。本发明的接合疫苗可制备成溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、粉剂等。抗原和免疫原性组合物可以与生理上可接受的与其兼容的载体混合。这些都可以包括水、生理食盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或它们的组合等。该接合疫苗可进一步含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂，以进一步提高效力。接合疫苗的施用可以包括通过各种途径递送，例如口服、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下和腹膜内施用。在另一方面，本发明提供了通过施用本发明的接合疫苗制备的抗体。以下实施方式仅用于说明本发明而非限制本发明。除非另有说明，本发明所用的所有百分比都是重量百分比。本发明引用的所有专利，专利申请和文献参考文献均以引用的方式并入本文。实施方式材料和方法分离噬菌体噬菌体的纯化和噬菌体的效价测定是以琼脂覆盖的方法进行分离；噬菌体的感染性则是使用斑点测试进行确定LinTL,HsiehPF,HuangYT,etal.IsolationofabacteriophageanditsdepolymerasespecificforK1capsuleofKlebsiellapneumoniae:implicationintypingandtreatment.TheJournalofinfectiousdiseases2014；210:1734-44。噬菌体基因组DNA制备和测序噬菌体的基因体DNA是以QIAGEN的λ试剂组提取，其方法是修改自如下文献LinTL,HsiehPF,HuangYT,etal.IsolationofabacteriophageanditsdepolymerasespecificforK1capsuleofKlebsiellapneumoniae:implicationintypingandtreatment.TheJournalofinfectiousdiseases2014；210:1734-44。将噬菌体沉淀和裂解后，用苯酚氯仿萃取DNA，并以乙醇进行沉淀，最后通过IlluminaGAII测序来确定噬菌体的基因体序列。蛋白质表达和纯化最近的研究已揭示了重组His标记的K1-ORF34蛋白的表达和纯化LinTL，HsiehPF，HuangYT，etal。IsolationofabacteriophageanditsdefolymerasespecificforK1capsuleofKlebsiellapneumoniae：implicationintypingandtreatment.Journalofinfectiousdiseases2014；210：1734-44。K2-orf16片段的扩增是先使用1611E-ORF16顺向引物5'-CAAACATCACGGTGACGCTAGCATGACCATTATCAAACG-3'；SEQIDNO：4和1611E-ORF16反向引物5'-CTTTTAACATTTAGCACTCGAGTGTAAAATTAATAATG-3'；SEQIDNO：5来进行PCR，再以NheI和XhoI限制酶进行分解，之后将经分解后的K2-orf16片段克隆到pET28c质粒Novagen中的NheI和XhoI双重分解位点亦经NheI和XhoI限制酶进行分解。K62荚膜解聚酶的扩增是先使用Ref-K10-1ORF6顺向引物5'-ATGAATAAGATGTTTACCCAG-3'；SEQIDNO：6和Ref-K10-1ORF6反向引物5'-AATTGGGCGAAGGCGTTCAAAC-3'；SEQIDNO：7进行PCR，然后克隆到pET28c质粒Novagen的钝化EcoRI分解位点中。将得到的质粒转化到BL21型大肠杆菌DE3中，利用0.4毫摩尔浓度mM的IPTG在16℃进行诱导过夜来表达重组His标签蛋白，并按照试剂盒Qiagen内说明书提供的方法进行蛋白质纯化。克雷伯氏肺炎杆菌荚膜多糖CPS的纯化分别从克雷伯氏肺炎杆菌NTUH-K2044ΔwbbO，NTUH-A4528ΔwbbO和K62referenceΔwbbO突变菌株中纯化出K1、K2及K62的荚膜多糖CPSHsiehPF,LinTL,YangFL,etal.LipopolysaccharideO1antigencontributestothevirulenceinKlebsiellapneumoniaecausingpyogenicliverabscess.PloSone2012；7:e33155，以消除O多糖的污染。细菌在Luria琼脂盘上，于37℃下培养12小时。将细菌收集并放入无菌水重量体积＝110中，在100℃下加热10分钟。冷却后，将细菌溶液以15,000xg离心20分钟。将上清液体积与冰冷的丙酮4倍体积混合以进行多糖沉淀。在12,000xg离心20分钟后，得到一未经加工的荚膜多糖CPS沉淀物。将该沉淀物打散并悬浮在无菌水中并冷冻干燥。未经加工的荚膜多糖CPS粉末在37℃下被核糖核酸酶Roche和脱氧核糖核酸酶IRoche分解24小时，然后与蛋白酶K在10毫摩尔浓度mM的三羟甲基氨基甲烷-HClpH7.4中进一步分解6至8小时。在100℃变性10分钟后，上清液以孔洞大小约为8至10千道尔顿的透析膜进行透析纯化并冷冻干燥。部分纯化的荚膜多糖CPS以0.1％叠氮化钠在过滤的纯水中进行洗脱，接着在TSKHW-65F管柱[1.6厘米直径×90厘米高度]上进一步纯化。通过苯酚-硫酸法检测含有碳水化合物的碎片并以纯水进行透析分子量阀值：1千道尔顿，并以冷冻干燥浓缩。荚膜多寡糖的荚膜多糖CPS结构分析先前的研究YangFLetal.,TheJournalofbiologicalchemistry2011,28624:21041-21051；CorsaroMMetal.,Carbohydrateresearch2005,34013:2212-2217已公开了克雷伯氏肺炎杆菌NTUH-K2044K1和A4528K2荚膜多糖的化学结构。质谱分析法：在基质辅助激光解析电离质谱分析上，先将0.5微升μl样品与0.5微升μl基质溶液20毫克毫升2,5-二羟基苯甲酸DHB混合在50％ACN和1％磷酸水溶液H3PO4中，得一混合液，将混合液点在不锈钢的盘子上，经空气干燥后，在4800型基质辅助激光解析电离-飞行时间飞行时间质谱分析仪AppliedBiosystems，FosterCity，CA上，以加速电压为20千伏特、电网电压为16％的正反射器模式下进行分析。典型的光谱是由1000个激光照射产生的。使用Data-Explorer软件AppliedBiosystemsTsaiCFetal.,Neuromethods2011,57:181-196，通过基线扣除和噪音去除处理原始光谱。在一次质谱分析上，在UltraflexII基质辅助激光解析电离-飞行时间飞行时间质谱仪BrukerDaltonikGmbH，Germany上进行测量。质谱是在质荷比mz范围从500到4,000的反射模式下获得的。质谱质谱分析是在升降机模式下进行的。质谱分析由中央研究院基因组研究中心的质谱仪实验室GRCMassCoreFacility进行。核磁共振光谱分析：本发明记录一重水中的小荚膜多糖CPS片段的核磁共振光谱分析结果；所有的二维核磁共振光谱分析实验都使用Bruker所提供的标准脉冲序列进行。核磁共振光谱分析数据是使用上旋转3.1处理。核磁共振光谱分析实验和共振分配：所有的核磁共振实验都在BrukerAVANCE600或AVANCE800核磁共振质谱仪Bruker，Karlsruhe，Germany上进行，配备有三重1H、13C和15N共振冷冻探针，包括一屏蔽z-梯度。收集二维2D1HNMR、TOCSY和NOESY光谱。所有重组蛋白质的异核核磁共振实验均按要求进行。通过CBCACONH、HNCACB、HNCO、HNCACO和CCONH的独立连接性分析实现骨架原子的序列特异性分配。1H共振使用3DHAHBCONH和HCCH-TOCSY分配。酶裂解：通过β-氢消除反应，以K1裂解酶将K1荚膜多糖CPS降解，以产生葡萄糖醛酸的C-4和C-5之间的双键，并测定其在232纳米波长吸光值的分光光度变化。在UV-VIS分光光度计Ultrospec4000UVVisible；AmershamPharmaciaBiotech，Piscataway，NJ，USA中，25℃的条件下，在1毫升体积的比色管中进行三次重复测定。将重组K1裂解酶10微克毫升加入到含有25毫摩尔浓度mM、pH7.5的三羟甲基氨基甲烷Tris、3毫摩尔浓度mM的氯化镁MgCl2和40微克毫升的荚膜多糖CPS的反应混合物中，随后测定15分钟的232纳米波长吸光值的增加。对照组则不含K1裂解酶。用3,5-二硝基水杨酸DNSA测定法对于K2水解酶来定量还原末端：本发明通过估算3,5-二硝基水杨酸还原糖的浓度的方法来确定水解酶活性DNASSigma-AldrichDannerMetal.,EuropeanjournalofbiochemistryFEBS1993,2153:653-661；MillerGLetal.,AnalyticalChemistry1959,313:426-428。当样品与DNSA混合并加热以催化反应时，通过装置FlexStation3将DNS的3'端的硝基还原成可在535纳米波长测量吸光值的氨。通过定量还原糖的浓度可以确定每种水解酶的条件。毛细管电泳：本发明式是在BeckmanPACEMDQ毛细管电泳系统上进行毛细管电泳，该毛细管电泳系统配备有设置在230纳米波长的UV检测器。在25℃下，以电动力学层析法涂覆的熔融石英毛细管内径77微米，总长度65厘米，从注射点到检测器50厘米进行分离和分析。操作缓冲液由磷酸钠缓冲液50毫摩尔浓度mM，pH9.0组成。将缓冲液通过孔洞直径0.2微米的膜滤器真空过滤脱气，并在超声波水槽中振荡。每次执行前，毛细管先以0.1摩尔浓度的NaOH清洗5分钟，再以二次蒸馏水清洗5分钟，然后用操作缓冲液处理5分钟。待分析的样品使用压力注射模式自动注射，其中样品加压15秒。使用正常极性，在20千伏特约65毫安下进行毛细管电泳。分解后的荚膜多糖CPS与DT-CRM197载体蛋白的接合以Kochetkov胺化制备糖基胺的方法：于还原糖水溶液20毫克的还原糖溶解在3.0毫升的二次蒸馏水中中加入碳酸铵3.0克，过量。将得到的悬浮液密封，并在室温下搅拌7天，之后将反应混合物冷冻干燥直至残余物的干重保持恒定而获得无色的固态糖基胺，且使用时不经进一步的纯化。通过糖基胺连接硫醇连接物的方法：于糖基胺溶液20毫克的糖基胺溶解在3.0毫升的磷酸盐缓冲生理盐水pH7.4中中加入3,3'-二硫代双磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯，DTSSP，20毫克，过量，之后加入1摩尔浓度的NaOH溶液使反应混合物维持在pH7.4至7.8，并在室温下搅拌16小时。于前述的溶液中加入二硫苏糖醇DTT，20毫克，过量，该混合物在40℃下搅拌1-2小时。最后进行减压除去溶剂，残留物经SephadexLH-20柱层析纯化，用二次蒸馏水洗脱，得到所需的产物：分解的荚膜多糖-硫醇CPS-SH。CRM197-马来酰亚胺CRM197-maleimid的合成：在通过交替溶解在水中并透析AmiconUltra-0.5，10千道尔顿将市售CRM1971.0毫克的盐除去之后，将残余物溶于磷酸盐缓冲生理盐水pH6.5，1.0毫升中，并转移到样品瓶。于该溶液中加入N-ε-马来酰亚胺maleimid己酰氧基磺基琥珀酰亚胺酯Sulfo-EMCS，1.0毫克，8.22×10-6摩尔，然后在室温下搅拌反应2小时，再用AmiconUltra-0.510千道尔顿纯化该混合物。在使用基质辅助激光解析电离-飞行时间光谱分析检查分子量和BCA测定以计算蛋白质的总量之后，将CRM197-马来酰亚胺CRM197-maleimid保存在磷酸盐缓冲生理盐水pH7.2，1.0毫克毫升中，于下一步使用。根据基质辅助激光解析电离-飞行时间光谱分析的数据，可以计算马来酰亚胺的官能团的数量。例如，当CRM197-马来酰亚胺CRM197-maleimid的分子量为61841时，便可以确定CRM197-马来酰亚胺CRM197-maleimid上的马来酰亚胺官能团的数量。分解的荚膜多糖-CRM197CPS-CRM197接合物1至4的合成：将CRM197-马来酰亚胺CRM197-maleimid溶于磷酸盐缓冲生理盐水pH7.2，1.0毫克毫升中，然后向溶液中加入不同量的分解的荚膜多糖-硫醇CPS-SH在磷酸盐缓冲生理盐水中为5.0毫克毫升，pH7.2。该混合物在室温下搅拌2小时。通过使用AmiconUltra-0.510千道尔顿来纯化经分解的荚膜多糖-CRM197CPS-CRM197接合物，以通过透析移除非反应性分解的荚膜多糖-硫醇CPS-SH和磷酸钠盐。再以通过基质辅助激光解析电离-飞行时间光谱分析来确定该所获得的经分解的荚膜多糖-CRM197CPS-CRM197接合物的碳水化合物掺入率。非反应性分解的荚膜多糖-硫醇CPS-SH与二硫苏糖醇DTT反应后，经LH-20管柱层析纯化即可回收。通过改变经分解的荚膜多糖-硫醇CPS-SH的量，我们可以将不同比例的寡糖抗原决定位接合到CRM197载体上。疫苗接种将荚膜多糖CPS接合的疫苗在磷酸盐缓冲生理盐水中稀释至浓度为100微克毫升，并将糖脂佐剂C34在二甲基亚砜DMSO中溶解至浓度为100微克毫升。100微升由荚膜多糖CPS接合疫苗2微克聚糖和2微克佐剂组成的疫苗混合物以肌肉注射IM的方式接种于小鼠。对于K1和K2疫苗：五周龄的雌性BALBc小鼠接受疫苗三次，每次间隔一周。对于K62疫苗：五周龄的雌性BALBc小鼠以每两周接种一次疫苗，共五次。对抗荚膜多糖CPS的抗体的检测通过斑点印迹试验将不同量的纯化的荚膜多糖CPS转移到膜上。通过培养疫苗接种后的小鼠的血清1：1000稀释来检测抗荚膜多糖CPS的抗体。血清杀菌试验小鼠血清在56℃下培养30分钟后，用生理盐水做二倍连续稀释12倍至1256倍。将25微升μl稀释的血清和12.5微升μl细菌悬浮液100菌落形成单位CFU，colony-formingunit在37℃下培养15分钟。培养后，加入12.5微升μl新生兔子的补体Pel-Freez，USA并在37℃下培养1小时。然后将反应混合物铺在LB盘上。培养至隔天后，计算存活细菌的数量。血清杀菌效价被定义为血清稀释度的倒数，对比于仅接种佐剂的对照组小鼠，接种疫苗小鼠的细菌-补体-血清达到50％的杀菌力。保护力分析对于K1和K2疫苗：疫苗接种后一周每组5只小鼠，包含疫苗接种的或对照小鼠仅佐剂，用腹腔注射IP方式接种1×104菌落形成单位CFU，colony-formingunit的NTUH-K2044或NTUH-A4528菌株。实验进行30天以观察小鼠的死亡率。通过Kaplan-Meier分析法并以log-rank检验分析小鼠的生存率；P值王锦堂克雷伯氏肺炎杆菌的荚膜多糖疫苗191286USUS62403,3652016-10-037PatentInversion3.51651PRTK1专一性噬菌体1MetAlaLeuIleArgLeuValAlaProGluArgValPheSerAspLeu151015AlaSerMetValAlaTyrProAsnPheGlnValGlnAspLysIleThr202530LeuLeuGlySerAlaGlyGlyAspPheThrPheThrThrThrAlaSer354045ValValAspAsnGlyThrValPheAlaValProGlyGlyTyrLeuLeu505560ArgLysPheValGlyProAlaTyrSerSerTrpPheSerAsnTrpThr65707580GlyIleValThrPheMetSerAlaProAsnArgHisLeuValValAsp859095ThrValLeuGlnAlaThrSerValLeuAsnIleLysSerAsnSerThr100105110LeuGluPheThrAspThrGlyArgIleLeuProAspAlaAlaValAla115120125ArgGlnValLeuAsnIleThrGlySerAlaProSerValPheValPro130135140LeuAlaAlaAspAlaAlaAlaGlySerLysValIleThrValAlaAla145150155160GlyAlaLeuSerAlaValLysGlyThrTyrLeuTyrLeuArgSerAsn165170175LysLeuCysAspGlyGlyProAsnThrTyrGlyValLysIleSerGln180185190IleArgLysValValGlyValSerThrSerGlyGlyValThrSerIle195200205ArgLeuAspLysAlaLeuHisTyrAsnTyrTyrLeuSerAspAlaAla210215220GluValGlyIleProThrMetValGluAsnValThrLeuValSerPro225230235240TyrIleAsnGluPheGlyTyrAspAspLeuAsnArgPhePheThrSer245250255GlyIleSerAlaAsnPheAlaAlaAspLeuHisIleGlnAspGlyVal260265270IleIleGlyAsnLysArgProGlyAlaSerAspIleGluGlyArgSer275280285AlaIleLysPheAsnAsnCysValAspSerThrValLysGlyThrCys290295300PheTyrAsnIleGlyTrpTyrGlyValGluValLeuGlyCysSerGlu305310315320AspThrGluValHisAspIleHisAlaMetAspValArgHisAlaIle325330335SerLeuAsnTrpGlnSerThrAlaAspGlyAspLysTrpGlyGluPro340345350IleGluPheLeuGlyValAsnCysGluAlaTyrSerThrThrGlnAla355360365GlyPheAspThrHisAspIleGlyLysArgValLysPheValArgCys370375380ValSerTyrAspSerAlaAspAspGlyPheGlnAlaArgThrAsnGly385390395400ValGluTyrLeuAsnCysArgAlaTyrArgAlaAlaMetAspGlyPhe405410415AlaSerAsnThrGlyValAlaPheProIleTyrArgGluCysLeuAla420425430TyrAspAsnValArgSerGlyPheAsnCysSerTyrGlyGlyGlyTyr435440445ValTyrAspCysGluAlaHisGlySerGlnAsnGlyValArgIleAsn450455460GlyGlyArgValLysGlyGlyArgTyrThrArgAsnSerSerSerHis465470475480IlePheValThrLysAspValAlaGluThrAlaGlnThrSerLeuGlu485490495IleAspGlyValSerMetArgTyrAspGlyThrGlyArgAlaValTyr500505510PheHisGlyThrValGlyIleAspProThrLeuValSerMetSerAsn515520525AsnAspMetThrGlyHisGlyLeuPheTrpAlaLeuLeuSerGlyTyr530535540ThrValGlnProThrProProArgMetSerArgAsnLeuLeuAspAsp545550555560ThrGlyIleArgGlyValAlaThrLeuValAlaGlyGluAlaThrVal565570575AsnAlaArgValArgGlyAsnPheGlySerValAlaAsnSerPheLys580585590TrpValSerGluValLysLeuThrArgLeuThrPheProSerSerAla595600605GlyAlaLeuThrValThrSerValAlaGlnAsnGlnAspValProThr610615620ProAsnProAspLeuAsnSerPheValIleArgSerSerAsnAlaAla625630635640AspValSerGlnValAlaTrpGluValTyrLeu6456502668PRT噬菌体1611E-K2-12MetThrIleIleLysArgAlaAspLeuGlyArgProLeuThrTrpAsp151015GluLeuAspAspAsnPheGlnGlnValAspAspLeuThrAlaAlaAla202530SerAlaAlaValLeuSerAlaSerAlaSerAlaThrAlaAlaAlaGly354045SerAlaThrAsnSerLeuAsnSerAlaAsnSerAlaAlaSerSerAla505560AspAspAlaAlaAlaSerAlaThrValAlaIleAsnAlaLeuMetAsn65707580SerThrPheGluProAlaAspPheAspPheThrSerGlyGlyThrLeu859095AspSerThrAspArgAsnLysAlaValTyrAsnProAlaAspAsnAsn100105110TrpTyrSerTrpSerGlyIleLeuProLysIleValThrAlaAlaThr115120125AspProThrAlaAspSerAsnTrpLysProArgThrAspGlnLeuLeu130135140ArgGlnAsnLeuAlaSerSerValIleProGlyThrSerLeuValThr145150155160HisSerAspGlyIleHisLeuAspAspTyrIleGluIlePheAsnArg165170175ArgThrLysPheIleMetProGluAspPheProGlyThrAspThrGlu180185190GlnLeuGlnSerAlaLeuSerTyrAlaLysSerAsnArgValAsnVal195200205ValLeuGlnAlaGlyLysThrTyrTyrValThrGlySerGlnGlyLeu210215220GluValAspLeuGlyTyrTyrSerPheGluSerProAsnGlyIleAla225230235240TyrIleAspPheThrGlyCysThrAlaThrTyrCysLeuTrpValHis245250255SerSerArgProTyrProAspGlySerGluAsnHisCysThrSerMet260265270ArgGlyIleLysPheLysSerSerValLysGlyIleGlyGlnArgLeu275280285LeuLeuThrGlyAsnAsnAsnAspSerSerAsnGlyThrTyrAsnGly290295300AspCysLysIleGluAsnCysMetPheSerThrAlaAspIleValLeu305310315320GlyAlaSerAsnSerThrTrpArgTyrLysPheIleAsnCysGlyPhe325330335MetMetGluSerThrGlyGlyThrTyrAlaMetHisPheProAlaGly340345350IleSerAspSerGlyGluSerValThrPheGlnAsnCysLysIlePhe355360365AspMetLysGlyCysProIleLeuValGluCysAlaSerPheAlaIle370375380GlyMetProGlyThrSerValLeuAsnThrProIleLysIleThrGly385390395400SerGlyAlaMetValIleMetAspSerAlaAlaAsnIleGluAsnPro405410415GlyAlaSerAlaTrpTyrArgTyrGlyGluValThrGlyThrGlyAla420425430ArgLeuIleLeuAsnGlyCysThrLeuValCysAsnAsnProSerLeu435440445GlnThrLysProLeuPheTyrValGlyAlaAsnAlaPheIleAspVal450455460ThrLeuValLysThrProGlyAsnAspTyrLeuPheGlnAsnGlyAsp465470475480GluGlyLeuArgThrPheValGluGlyAspGlyTyrValThrAlaSer485490495HisCysIleGlyAspIleLeuSerGlyValGlyAsnIleProLeuHis500505510LysSerLeuAsnProThrLeuAsnProGlyPheGluThrGlyAspLeu515520525SerSerTrpSerPheAsnAsnGlnGlySerAlaSerGlnThrCysVal530535540ValGlyThrAlaTyrLysLysThrGlyThrTyrGlyAlaArgMetThr545550555560SerPheGlySerLeuSerCysPheLeuThrGlnLysValLysValThr565570575GlnHisGlyTyrTyrSerThrThrCysGlnIleAsnThrIleThrAla580585590GlyThrGlyThrThrAlaGlySerLeuThrIleThrPheTyrAsnArg595600605AspGlyAsnAlaLeuGlnAlaGlyAlaSerSerAsnPheThrAsnThr610615620ProSerGlyTrpGlnSerValGlyArgPheIleGlnGlyArgValPro625630635640GlnAlaAlaGluTyrCysGluValSerPheArgCysArgGluGlyAla645650655ValIleAspValAspAsnPheIleIleAsnPheThr6606653535PRT人工序列合成多肽；载体蛋白3GlyAlaAspAspValValAspSerSerLysSerPheValMetGluAsn151015PheSerSerTyrHisGlyThrLysProGlyTyrValAspSerIleGln202530LysGlyIleGlnLysProLysSerGlyThrGlnGlyAsnTyrAspAsp354045AspTrpLysGluPheTyrSerThrAspAsnLysTyrAspAlaAlaGly505560TyrSerValAspAsnGluAsnProLeuSerGlyLysAlaGlyGlyVal65707580ValLysValThrTyrProGlyLeuThrLysValLeuAlaLeuLysVal859095AspAsnAlaGluThrIleLysLysGluLeuGlyLeuSerLeuThrGlu100105110ProLeuMetGluGlnValGlyThrGluGluPheIleLysArgPheGly115120125AspGlyAlaSerArgValValLeuSerLeuProPheAlaGluGlySer130135140SerSerValGluTyrIleAsnAsnTrpGluGlnAlaLysAlaLeuSer145150155160ValGluLeuGluIleAsnPheGluThrArgGlyLysArgGlyGlnAsp165170175AlaMetTyrGluTyrMetAlaGlnAlaCysAlaGlyAsnArgValArg180185190ArgSerValGlySerSerLeuSerCysIleAsnLeuAspTrpAspVal195200205IleArgAspLysThrLysThrLysIleGluSerLeuLysGluHisGly210215220ProIleLysAsnLysMetSerGluSerProAsnLysThrValSerGlu225230235240GluLysAlaLysGlnTyrLeuGluGluPheHisGlnThrAlaLeuGlu245250255HisProGluLeuSerGluLeuLysThrValThrGlyThrAsnProVal260265270PheAlaGlyAlaAsnTyrAlaAlaTrpAlaValAsnValAlaGlnVal275280285IleAspSerGluThrAlaAspAsnLeuGluLysThrThrAlaAlaLeu290295300SerIleLeuProGlyIleGlySerValMetGlyIleAlaAspGlyAla305310315320ValHisHisAsnThrGluGluIleValAlaGlnSerIleAlaLeuSer325330335SerLeuMetValAlaGlnAlaIleProLeuValGlyGluLeuValAsp340345350IleGlyPheAlaAlaTyrAsnPheValGluSerIleIleAsnLeuPhe355360365GlnValValHisAsnSerTyrAsnArgProAlaTyrSerProGlyHis370375380LysThrGlnProPheLeuHisAspGlyTyrAlaValSerTrpAsnThr385390395400ValGluAspSerIleIleArgThrGlyPheGlnGlyGluSerGlyHis405410415AspIleLysIleThrAlaGluAsnThrProLeuProIleAlaGlyVal420425430LeuLeuProThrIleProGlyLysLeuAspValAsnLysSerLysThr435440445HisIleSerValAsnGlyArgLysIleArgMetArgCysArgAlaIle450455460AspGlyAspValThrPheCysArgProLysSerProValTyrValGly465470475480AsnGlyValHisAlaAsnLeuHisValAlaPheHisArgSerSerSer485490495GluLysIleHisSerAsnGluIleSerSerAspSerIleGlyValLeu500505510GlyTyrGlnLysThrValAspHisThrLysValAsnSerLysLeuSer515520525LeuPhePheGluIleLysSer530535439DNA人工序列合成多核苷酸；1611E-ORF16顺向引物4caaacatcacggtgacgctagcatgaccattatcaaacg39538DNA人工序列合成多核苷酸；1611E-ORF16反向引物5cttttaacatttagcactcgagtgtaaaattaataatg38621DNA人工序列合成多核苷酸；Ref-K10-1ORF6顺向引物6atgaataagatgtttacccag21722DNA人工序列合成多核苷酸；Ref-K10-1ORF6反向引物7aattgggcgaaggcgttcaaac22

权利要求：1.一种免疫原，包含具有下式（I）的克雷伯氏肺炎杆菌K1荚膜多糖的三糖的重复单元：其中m为1至4。2.如权利要求1所述的免疫原，其中m为2。3.一种免疫原，包含具有下式（II）的克雷伯氏肺炎杆菌K2荚膜多糖的四糖的重复单元：其中n为1至4。4.如权利要求3所述的免疫原，其含有一个重复单元（n＝1）。5.一种免疫原，包含具有下式（III）的克雷伯氏肺炎杆菌K64荚膜多糖的六糖的重复单元：其中n为1至4。6.如权利要求5所述的免疫原，其中n为1。7.一种免疫原，包含具有下式（IV）的克雷伯氏肺炎杆菌K62荚膜多糖的五糖的重复单元：其中n为1至4。8.如权利要求7所述的免疫原，其中n为2。9.一种免疫原，包含具有下式（V）的克雷伯氏肺炎杆菌K24荚膜多糖的五糖的重复单元：其中n为1至4。10.如权利要求9所述的免疫原，其中n为1。11.一种免疫原，包含具有下式（VI）的克雷伯氏肺炎杆菌K28荚膜多糖的六糖的重复单元：其中n为1至4。12.如权利要求11所述的免疫原，其中n为1。13.一种免疫原，包含具有克雷伯氏肺炎杆菌KN2荚膜多糖的六糖的重复单元，其具有四个己糖和一个己糖醛酸，其分子量约为1027。14.一种分离的多肽或其变体，具有特异于克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiellapneumoniae）荚膜型K2菌株的荚膜的降解活性，其选自：（a）包含SEQIDNO：2的氨基酸序列的多肽；及（b）多核苷酸编码的多肽，其是至少在高严格条件下与（i）SEQIDNO:2的多肽编码序列，或（ii）（i）的全长互补链杂交的多核苷酸。15.如权利要求14所述的多肽，其具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。16.一种疫苗，包含一种或多种选自如权利要求1、3、4、7、9和11所定义的式（I）至（VI）的免疫原。17.如权利要求16所述的疫苗，其中所述免疫原接合至载体。18.如权利要求16所述的疫苗，其是包含如权利要求1和3所定义的式I和式II的免疫原的K1和K2荚膜多糖接合二价疫苗。19.如权利要16所述的疫苗，其是包含免疫原I-载体和免疫原II-载体的混合物的K1和K2荚膜多糖的接合二价疫苗，其中具有如权利要求1中定义的式（I）的免疫原I和如权利要求3中定义的式（II）的免疫原II，并分别接合至载体。20.如权利要求16所述的疫苗，其是含有如权利要求5和7中定义的式Ⅲ和式Ⅳ的免疫原的K64和K62荚膜多糖的接合二价疫苗。21.如权利要求16所述的疫苗，其是含有免疫原III-载体和免疫原IV-载体的混合物的K64和K62荚膜多糖（CPS）接合的二价疫苗，其中具有如权利要求5中定义的式III的免疫原III及具有如权利要求7中定义的式IV的免疫原IV分别与载体接合。22.如权利要求17、19及21所述的疫苗，其中所述的载体是蛋白质、肽、脂质、聚合物、树状聚合物、病毒体、类病毒颗粒（VLP）或其组合。23.如权利要求17、19及21所述的疫苗，其中所述的载体是蛋白质载体。24.如权利要求23所述的疫苗，其中所述蛋白质载体是细菌类毒素、毒素、外毒素及其无毒衍生物，如钥孔虫戚血蓝蛋白（KLH），B型肝炎病毒核心蛋白、甲状腺球蛋白、白蛋白（例如，牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）和卵清蛋白）、肺炎球菌表面蛋白A（PspA）、肺炎球菌粘附蛋白（PsaA）、结核菌素纯化蛋白衍生物（PPD）；运铁蛋白结合蛋白、聚氨基酸（如聚（赖氨酸：谷氨酸））、破伤风类毒素、破伤风毒素片段C，白喉类毒素，CRM（无毒白喉毒素突变体），霍乱毒素，金黄色葡萄球菌外毒素或类毒素，大肠杆菌热不稳定性肠毒素，铜绿假单胞菌外毒素A和细菌外膜蛋白（如脑膜炎奈瑟氏菌血清型B外膜蛋白复合物（OMPC）和外膜3类孔蛋白（rPorB））。25.如权利要求23所述的疫苗，其中所述蛋白质载体是具有SEQIDNO：3所示氨基酸序列的CRM197。26.一种引发针对克雷伯氏肺炎杆菌的免疫反应的方法，包括将权利要求1至13中任一项所述的免疫原或权利要求16至25中任一项所述的疫苗施用至对象。27.通过权利要求26所述的方法获得的抗体。28.一种预防克雷伯氏肺炎杆菌感染的方法，包括将有效剂量的权利要求1至13中任一项所述的免疫原或权利要求16至25中任一项所述的疫苗施用至对象。

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