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申请/专利权人：东莞市松山湖中心医院(东莞市石龙人民医院、东莞市第三人民医院、东莞市心血管病研究所)

摘要：本发明公开了一种研究Nrf2ARE信号通路在白藜芦醇保护多巴胺能神经细胞的作用机制的方法，其步骤为：步骤a、细胞培养；步骤b、药物分组及处理；步骤c、检测MES23.5细胞存活率；步骤d、后续实验；步骤e、观察细胞数量和形态；步骤f、检测细胞凋亡率；步骤g、进行线粒体膜电位检测；步骤h、检测抗氧化作用的Nrf2信号通路，以确定白藜芦醇联合L‑Dopa对MES23.5细胞发挥抗氧化作用的机制；步骤i、数据分析。本发明的方法能确定白藜芦醇联合L‑Dopa发挥作用时的通路机制，进而可为PD症状性治疗及神经保护性治疗提供理论依据，并为白藜芦醇协同L‑Dopa通过抗氧化机制对PD修饰治疗提供新的思路。

主权项：1.研究Nrf2ARE信号通路在白藜芦醇保护多巴胺能神经细胞的作用机制的方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：步骤a、MPP+诱导MES23.5多巴胺神经元细胞构建PD细胞模型：将MES23.5细胞置于DMEMF12培养基中，并于温度为37°C、CO2含量为5%的细胞培养箱内进行培养；当细胞融合至80%-90%时，通过细胞瓶收集细胞且进行传代分瓶培养，并进行隔天换液操作；步骤b、药物分组及处理：将步骤a所培养获得MES23.5细胞分为6组，且依次为：阴性对照组、MPP+组、MPP++白藜芦醇25μM组、MPP++白藜芦醇50μM组、MPP++白藜芦醇100μM组、MPP++白藜芦醇200μM组；处理时，MPP++白藜芦醇25μM组、MPP++白藜芦醇50μM组、MPP++白藜芦醇100μM组、MPP++白藜芦醇200μM组中的MES23.5细胞先分别用白藜芦醇预处理30min，MPP++白藜芦醇25μM组中的白藜芦醇药物浓度为25μmolL，MPP++白藜芦醇50μM组中的白藜芦醇药物浓度为50μmolL，MPP++白藜芦醇100μM组中的白藜芦醇药物浓度为100μmolL，MPP++白藜芦醇200μM组中的白藜芦醇药物浓度为200μmolL；MPP+组以及经过白藜芦醇预处理的各组用MPP+诱导24h，MPP+诱导的各组中的MPP+药物浓度为200μmolL；步骤c、检测MES23.5细胞存活率，通过比较各组MES23.5细胞的存活率，在4组不同浓度的白藜芦醇干预组中，选择存活率最高组的白藜芦醇药物浓度，并将此白藜芦醇药物浓度作为后续实验中白藜芦醇的添加计量；步骤d、后续实验：将步骤a所培养获得的MES23.5细胞分为4组，且依次为：阴性对照组、MPP+组、MPP++L-Dopa组、MPP++L-Dopa+白藜芦醇组；处理时，MPP++L-Dopa组中的MES23.5细胞先用L-Dopa预处理30min，MPP++L-Dopa+白藜芦醇组中MES23.5细胞先用L-Dopa、白藜芦醇预处理30min；MPP++L-Dopa组、MPP++L-Dopa+白藜芦醇组中的L-Dopa药物浓度分别为150μmolL，MPP++L-Dopa+白藜芦醇组中的白藜芦醇药物浓度为根据步骤c所确定的白藜芦醇药物浓度；MPP+组以及经过预处理的各组用MPP+诱导24h，MPP+诱导的各组中的MPP+药物浓度为200μmolL；步骤e、观察经过步骤d后的MES23.5细胞的数量和形态：用免疫细胞化学染色检测MPP+诱导后TH阳性细胞数及细胞体积；并用Hoechst33258细胞核染料进行细胞核染色操作，以观察MPP+诱导后凋亡细胞的形态；步骤f、通过流式细胞术FCM检测经过步骤d后的各组MES23.5细胞凋亡率；步骤g、对经过步骤d后的各组MES23.5细胞进行线粒体膜电位检测；步骤h、通过特异性阻断剂LY294002检测抗氧化作用的Nrf2信号通路，以确定白藜芦醇联合L-Dopa对MES23.5细胞发挥抗氧化作用的机制：将步骤a所培养获得的MES23.5细胞分为4组，且依次为：MPP+组、MPP++L-Dopa+白藜芦醇组，MPP++LY294002组，MPP++L-Dopa+白藜芦醇+LY294002组；处理时，MPP++L-Dopa+白藜芦醇组中的MES23.5细胞先用L-Dopa、白藜芦醇预处理30min，MPP++LY294002组中的MES23.5细胞先用LY294002预处理30min，MPP++L-Dopa+白藜芦醇+LY294002组中的MES23.5细胞先用L-Dopa、白藜芦醇、LY294002预处理30min；预处理完成后，MPP+组以及经过预处理的各组用MPP+诱导24h，而后检测Nrf2信号通路上血红素加氧酶-1（HO-1）、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、谷氨酰半胱氨酸连接酶调节亚基（GCLM）蛋白的表达水平；步骤i、数据分析：采用GraphpadPrism5进行分析与作图，并采用AdobeIllustratorCS6进行整理合图；所有数据均以means±SD表示，组间统计学差异采用one-wayANOVA和Tukey’s检验，P值小于0.05认为有显著性差异。

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