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申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明公开了一种纳米聚苯乙烯微球引起IEC‑6细胞坏死性凋亡的检测方法，属于纳米生物材料毒性技术领域。该方法是通过实验室验证纳米微塑料引起细胞毒性及细胞坏死性凋亡的验证体系，通过检测细胞内溶酶体组织酶泄露、细胞内钙离子增多显示细胞损伤表现，通过检测细胞坏死性凋亡的通路蛋白验证其激活表现。该方法属于纳米微塑料引起细胞毒性及坏死性凋亡机制研究的证明，补充了纳米微塑料对细胞毒性及程序性死亡通路的方向。

主权项：1.一种纳米聚苯乙烯微球引起IEC-6细胞坏死性凋亡的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：1双抗体免疫荧光染色：S1、选用培养基A，在35-37℃、充有质量分数5％CO2的细胞培养箱内进行IEC-6细胞的培养，待IEC-6细胞充满培养基后制备成IEC-6细胞悬液；S2、选取无菌细胞爬片铺设于24孔板底，将S1中的细胞悬液加入铺好的孔中，使用培养基A、35-37℃、充有质量分数5％CO2的细胞培养箱内继续培养20-24h，待细胞完全贴壁后，移除原有的培养基A；S3、重新加入质量浓度为100μgmL的纳米聚苯乙烯微球悬液，使用培养基A、35-37℃、充有质量分数5％CO2的细胞培养箱内继续培养70-72h；S4、将S3中培养完成的细胞爬片取出，用磷酸缓冲液清洗3-4次后，选用1％的山羊血清封闭30min。之后加入CTSB的一抗稀释液和LAMP2一抗稀释液，4℃孵育过夜。用磷酸缓冲液清洗3次后，加入红色标记的抗CTSB的二抗和绿色标记的抗LAMP2的二抗，常温孵育1小时，后用磷酸缓冲液冲洗3次进行免疫荧光染色、选用DAPI染色试剂盒进行细胞核染色；S5、将S4中完成免疫荧光染色的细胞爬片，用抗荧光封片剂封片后，观察并拍摄样片；2钙离子探针Fluo-4AM的活细胞染色：S6、选取S1中的IEC-6细胞悬液加入共聚焦皿中，使用培养基A、35-37℃、充有质量分数5％CO2的细胞培养箱内培养20-24h，待细胞完全贴壁后，移除原有培养基A；S7、重新加入质量浓度为100μgmL的纳米聚苯乙烯微球悬液，使用培养基A、35-37℃、充有质量分数5％CO2的细胞培养箱内继续培养70-72h；S8、将S7原有培养基移除后，用磷酸缓冲液清洗3-4次后，使用钙离子探针Fluo-4AM试剂盒对细胞进行染色，观察并拍摄样片；3ROS探针的活细胞染色：S9、将S7原有培养基移除后，用磷酸缓冲液清洗3-4次后，使用ROS探针试剂盒对细胞进行染色，观察并拍摄样片；4WB检测坏死性凋亡通路蛋白S10、选取S1中的IEC-6细胞悬液加入细胞培养基6孔板中，使用使用培养基A、35-37℃、充有质量分数5％CO2的细胞培养箱内培养20-24h，待细胞完全贴壁后，移除原有培养基A；S11、重新加入质量浓度为100μgmL的纳米聚苯乙烯微球悬液，使用培养基A、35-37℃、充有质量分数5％CO2的细胞培养箱内继续培养70-72h；S12、将S11中原有培养基移除后，用磷酸缓冲液清洗，按细胞蛋白提取流程，提取细胞内总蛋白，按WB流程进行检测；S13、用ImageJ软件，对获得的蛋白条带进行灰度值分析。

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百度查询： 中国农业大学 一种纳米聚苯乙烯微球引起IEC-6细胞坏死性凋亡的检测方法