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申请/专利权人：徐州医科大学

摘要：本发明提供了一种链交换等温扩增结合纳米荧光微球‑免疫层析技术快速精准检测婴儿肺炎克雷伯菌新方法。该方法包括：以肺炎克雷伯菌特异性靶基因mdh为靶标，进行寡核苷酸引物的设计与合成；提取肺炎克雷伯菌基因组DNA，利用上述的引物进行SEA扩增反应，获得扩增产物；采用磁性纳米粒子对SEA扩增产物进行纯化，并通过纳米荧光微球免疫层析试纸条进行婴儿肺炎克雷伯菌快速定量检测。本发明将纳米荧光微球材料用于荧光侧向层析检测平台，结合链交换等温扩增等信号放大技术，大大提高了检测系统的灵敏度和特异性；检测新技术应用性强，可进行婴儿肺炎克雷伯菌等重要致病菌的快速精准检测，符合国家实际需求，具有产业化前景。

主权项：1.一种非诊断目的的链交换等温扩增结合纳米荧光微球-免疫层析技术SEA-FICTS快速精准检测婴儿肺炎克雷伯菌方法，该方法包括：以肺炎克雷伯菌特异性靶基因mdh为靶标，进行寡核苷酸引物的设计与合成；所述引物的序列如下：上游引物：5’-CGTTCCGACCTGTTTAATGTG-3’下游引物：5’-GGTTCTTCACGATACCCGC-3’；提取肺炎克雷伯菌基因组DNA，利用上述的特异性引物进行SEA等温扩增反应，获得扩增产物；采用磁性纳米粒子对SEA扩增获得的样品产物进行纯化，去除假阳性结果；具体为：1取5μL的SEA扩增的样品产物于样品管中，加入9μL的SEA产物处理液，轻柔混匀5s，室温静置结合5min，期间颠倒混匀2次；2接着将样品管置于磁力架上进行磁分离，吸弃废液；3然后向样品管内慢慢加入200μL、85％乙醇，保持样品管于磁力架上2min，确保磁性纳米粒子始终被吸附在管壁上，吸弃废液；4重复上述步骤3；5将样品管于室温放置3～5min，至乙醇完全挥发；6取下样品管，加入100μL的上样缓冲液，所述上样缓冲液为pH7.4的PBS，充分混匀，室温放置5min，期间颠倒混匀2次；7将样品管置于磁力架上进行磁分离，小心吸取上清至新的离心管中，获得的纯化液保存备用；最后采用纳米荧光微球免疫层析试纸条进行婴儿肺炎克雷伯菌快速定量检测；具体步骤包括：1取出免疫层析试纸条卡，做好标记；2将100μL的上样缓冲液垂直加入到检测卡上做空白对照，将100μL处理后的SEA产物纯化液垂直滴加于加样孔，室温放置2min，所述上样缓冲液为pH7.4的PBS；3进行免疫层析试纸条的上机检测定性和定量分析，记录数值，实现肺炎克雷伯菌基因的定性和定量检测；其中，所述免疫层析试纸条卡的制备包括：将样品垫用pH7.4PBS缓冲液浸泡处理，置于干燥箱中干燥，2h后取出备用；将荧光微球-链霉亲和素溶液喷至NC膜上、抗地高辛抗体喷至检测线区，生物素-牛血清蛋白喷至质控线区，喷量为0.65uLcm，37℃真空干燥过夜；之后将样本垫、NC膜、吸收垫依次粘贴在PVC底板上，组装好后将其切成4mm宽的试纸条，装卡，放入铝箔袋中，加入干燥剂密封保存备用。

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