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申请/专利权人：滨州医学院烟台附属医院

摘要：本发明涉及细胞分离培养领域，特别涉及一种小鼠肝脏来源iNKT细胞的分离和培养方法，分离出的原代iNKT细胞可应用于免疫介导的肝损伤研究，用以模拟人类自身免疫性肝炎发生发展过程。本发明涉及的方法具体包括以下步骤：将小鼠麻醉后采用胶原酶溶液灌注消化肝脏得到细胞悬液，通过一系列密度梯度分离纯化步骤得到肝单个核细胞，经分选型流式细胞仪分选出iNKT细胞，iNKT细胞用改良RPMI‑1640培养基培养，并往其中加入鼠白介素‑2细胞因子、白介素‑7细胞因子、鼠白介素‑12细胞因子和可溶性抗CD‑28抗体用以刺激iNKT细胞扩增，经历为期3周的培养周期后可使iNKT细胞数量达到百万级以上，满足基础和临床研究需求。

主权项：1.一种小鼠肝脏来源iNKT细胞的分离和培养方法，其特征在于，分离流程包括以下步骤：S1.胶原酶溶液配制：用适量RPMI-1640充分溶解IV型胶原酶，配制成浓度为1mgml的胶原酶溶液，用0.45μm过滤器除菌，于37℃水浴锅中预热20-30min以备用；S2.33％percoll分离液配制：将percoll原液用10×PBS浓缩液稀释成等渗percoll，用PBS将等渗percoll稀释成33％percoll；S3.对小鼠处理后，用三通阀将输液针、装有D-Hanks液和装有预热好的胶原酶溶液的输液瓶连接妥当，调节三通阀先让D-Hanks液灌洗肝脏以洗去血液，直至引流液清亮为止，再调节三通阀让胶原酶溶液灌注肝脏，消化肝脏约30min；S4.消化过程结束，用镊子撕破肝包膜，将所得细胞悬液反复经200目细胞过滤筛过滤，如遇细小组织块可进行研磨，收集细胞悬液于50ml离心管中；离心管内细胞悬液在4℃条件下自然沉降15-30min后分层；S5.肝单个核细胞分离获取：取上层悬液收集于15ml离心管中，4℃条件，250×g离心5min，弃上清，PBS洗两次后离心得沉淀，用5ml的33％percoll重悬细胞沉淀，室温，850×g离心30min，收集下层沉淀并反复经300目细胞过滤筛过滤，250×g离心5min，弃上清，加10ml红细胞裂解液充分裂解，250×g离心5min，弃上清，PBS洗两次后得沉淀；S6.将细胞悬液滴于细胞计数板上进行计数，用于后续分选准备；S7.分选出iNKT细胞：根据步骤S6中的细胞计数结果，将肝单个核细胞以适宜浓度重悬于流式管中，根据要分选的细胞类型加入对应的流式抗体孵育，PBS洗涤重悬后离心以洗去未结合的抗体，加入500μl的RPMI-1640充分混匀待用；S8.按照实验室要求完成实验室环境消毒和所用仪器消毒，保证分选出的iNKT细胞处于无菌环境，便于后续培养和扩增。

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