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申请/专利权人：青岛农业大学;榆林学院;西南大学

摘要：本发明公开了一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子的制备，步骤如下：S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因；S2、构建真核表达重组质粒；S3、真核表达质粒转染MDBK细胞；S5、真核表达蛋白纯；S7、右旋糖酐磁珠磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子制备。本发明采用上述的一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV‑1病毒粒子的制备与应用，通过将囊膜蛋白固定在右旋糖酐磁珠表面制备出粒径小，却具有近乎BoHV‑1完整抗原性的亚单位疫苗，同时通过PEG化还可以延长蛋白在体内的存在时间，来延长免疫反应持续期。

主权项：1.一种右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子的制备方法，其特征在于，步骤如下：S1、合成牛疱疹病毒gB、gC、gD蛋白基因按照GeneBank公布的BoHV-1gB、gC、gD基因序列，合成各个基因后，在gB上游加入HindⅢ酶切位点，其下游加入AgeⅠ酶切位点，gCgD上游加入KpnⅠ酶切位点，其下游加入BSTBⅠ酶切位点；S2、构建真核表达重组质粒合成基因与pcDNA4-Myc-his真核表达质粒双酶切后连接构建pcDNA4-gB-hispcDNA4-gC-hispcDNA4-gD-his真核表达质粒，真核表达质粒转化DH5α大肠杆菌感受态以后，挑菌纯化后大量培养使用英国biologicaltool无内毒素质粒大提试剂盒提取以上真核表达质粒；S3、真核表达质粒转染MDBK细胞用PEI磁珠质粒转染法将以上真核表达质粒转染MDBK细胞系；转染细胞系的操作如下：A、贴壁转染1细胞按照传代步骤操作，105个mL铺6孔板贴壁铺满孔后开始转染；2DNA与PEI磁珠无菌混合后用无菌ddH2O稀释5倍后备用；3消化后细胞弃去原培养基，无菌PBS清洗2遍；4将2步磁珠加入到3步细胞中，37℃CO2培养箱中培养20-30min；5加入正常的培养基继续培养，按正常传代操作进行；B、悬浮转染1贴壁细胞消化后，300×gmin离心5min沉淀细胞弃掉培养基PBS清洗2遍在离心管中备用；2将DNA和磁珠按附表比例混合后，用无菌ddH2O稀释5倍后备用；3将上步混合物加入细胞中吹打悬浮细胞；4上步混合物放入培养箱培养20-30min；5加入新鲜培养基转移到培养瓶或者培养皿中继续培养传代；S4、构建真核表达细胞系转染48h后加入含有10％FBS和500μgmLzeocineDMEM培养基37℃5％CO2培养48h将未转染成功的细胞杀死；S5、真核表达蛋白纯收取细胞培养上清和转染成功MDBK细胞，MDBK细胞经超声破碎后，12000×g离心30min沉淀细胞碎片收取上清用于下步纯化；用镍磁珠对his标签蛋白进行纯化步骤如下：1磁珠洗涤：将磁珠用磁铁吸附后加入适当体积2×bindingwashbuffer洗涤2次，洗去磁珠保存液；2待纯化样品加入等体积的lysisbuffer之后颠倒混匀；3磁珠颠倒混匀后取适量体积磁珠加入上一步样品中，颠倒混匀3min；4磁铁吸附磁珠，待磁珠吸附完全样品澄清后弃掉样品保留磁珠；5加入5mL2×bindingwashbuffer摇晃混匀后，磁铁再次吸附磁珠，重复3次弃液体；6将上一步残余液体用移液器吸干后加入hiselutionbuffer1mL浸泡磁珠2min后，磁铁吸附磁珠，收集液体放入另一个新的离心管中；7重复步骤5两次后，5mL水保存磁珠；S6、真核表达蛋白鉴定；S7、右旋糖酐磁珠模拟BoHV-1病毒粒子制备，制备过程如下：A、磁珠最大偶联蛋白量确定取1mL50纳米羧基右旋糖酐磁珠梯度加入1:1:1混合的gB、gC、gD蛋白，分别以40μg、50μg、60μg、70μg、80μg加入1mgmL的EDC活化剂室温孵育1h，10000×g离心20min沉淀磁珠，取上清测定上清中蛋白浓度，确定饱和偶联最佳偶联量；B、PEG600最佳包裹量确定将上步偶联好蛋白的磁珠离心用PBS清洗2次，梯度加入双羧基PEG60010μL、20μL、30μL、40μL，并加入1mgmLEDC室温反应30min，离心酸碱滴定测定上清中羧基含量。

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