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申请/专利权人：中国科学院大连化学物理研究所

摘要：本发明公开了一种针对少量细胞15‑25个采用微探针取样‑多通道芯片纳喷‑高分辨质谱技术的高灵敏、高通量脂质组学分析方法。该方法采用毛细管微探针在显微镜下精准取样15‑25个动物细胞，在孔板中直接进行脂质提取，经多通道芯片纳喷离子源直接进入高分辨质谱进行分析，采用拼接式分段扫描模式采集一级质谱信息，经数据库匹配后得到可定性的脂质。本发明实现了单次分析仅需2分钟的通量，从20个乳腺癌细胞中就可鉴定出超过500个脂质，具有流程简单、灵敏度高、分析通量高的特点，适合于难以获取的稀有细胞，如干细胞、循环肿瘤细胞脂质组的高灵敏、高通量分析。

主权项：1.一种少量细胞脂质组学分析方法，是基于微探针取样-多通道芯片纳喷-高分辨质谱技术的少量细胞脂质组学高灵敏、高通量分析方法，其特征在于：（1）借助三维微移动操作平台，在显微镜下使用毛细管微探针，在负压作用下吸取15-25个少量细胞；（2）将15-25个少量细胞经注射泵注入96-384孔板中，并加入10-20μL喷雾溶剂，在0-4℃下静置0.5-1min，进行脂质提取;（3）置于孔板中的脂质提取样品经多通道芯片纳喷离子源AdvionNanoMate的自动进样器直接进入高分辨质谱进行分析，采用拼接式分段扫描模式对一级质谱信息进行采集；对上述过程进行6-10次重复，并分别对数据进行峰匹配，得到包含质荷比mz和峰强度的特征离子总峰表；扣除溶剂空白、信噪比小于10及在6-10次重复中出现频率低于80%的特征离子后，得到稳定存在的特征离子列表，再将样品中的一级mz和LipidMaps数据库中的精确mz进行匹配，设置质量精度为±3ppm，得到15-25个少量细胞中可定性的脂质列表；步骤（2）中将吸取的15-25个动物细胞经注射泵注入孔板中，并加入10-20μL喷雾溶剂进行脂质提取，其在正离子模式的组成为氯仿：甲醇：异丙=1:2:4，vvv，其中5mM甲酸铵和0.2%甲酸作为修饰剂；负离子模式下其组成为氯仿：甲醇：异丙醇=2:3:5，vvv，其中5mM乙酸铵作为修饰剂；正负离子模式下的喷雾溶剂中皆含有12种脂质内标，包括溶血磷脂酰胆碱LPC12:0、磷脂酰胆碱PC15:015:0、磷脂酰乙醇胺PE15:015:0、磷脂酰甘油PG15:015:0、甘油磷脂酸PA17:017:0、磷脂酰丝氨酸PS16:016:0-d62、神经酰胺Cerd18:117:0、鞘磷脂SMd18:112:0、甘油二酯DG12:012:0、甘油三酯TG15:015:015:0、胆固醇酯ChoE17:0、游离脂肪酸FFA18:0-d3，内标浓度范围为0.01-0.05μgml；上述混合溶液在0-4℃下静置0.5-1min，完成脂质提取；步骤（3）中脂质提取样品经多通道芯片纳喷离子源的自动进样器直接进入高分辨质谱进行分析，采用拼接式分段扫描模式采集一级质谱信息；多通道芯片纳喷离子源-高分辨质谱的操作条件如下：3.1）多通道芯片纳喷离子源条件：D型芯片，喷嘴内径4.1μm；正离子模式的喷雾电压为+1.5kV，负离子模式的喷雾电压为-1.8kV；气压为0.6psi；进样室温度为4℃；样品体积为5μL;3.2）高分辨组合型四级杆-轨道阱质谱ThermoScientific，QExactive-HF条件：离子传输管温度为275℃；正离子模式下的一级mz拼接式分段扫描窗口分别设置为290-390、380-480、470-570、560-610、600-650、640-690、680-730、720-770、760-810、800-850、840-940、930-1030、1020-1120、1110-1210、1200-1300Da；负离子模式下的一级mz拼接式分段扫描窗口分别为150-250、240-340、330-430、420-520、510-610、600-650、640-690、680-730、720-770、760-810、800-850、840-940、930-1030、1020-1120、1110-1210、1200-1300Da；微扫描设为3；分辨率为240K；注射时间设为200ms；动态增益控制为1e6，采集时间为0.6min。

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