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申请/专利权人：序康医疗科技(苏州)有限公司

摘要：本发明属于基因工程领域，更具体地涉及一种大片段DNA环化连接方法及其在测序文库构建中的应用，和用于实现所述方法和应用的试剂盒和由此形成的环化DNA分子和测序文库。

主权项：1.一种DNA环化连接方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：i在靶DNA片段的两端加上环化接头，以得到带有环化接头的靶DNA片段，其中，所述环化接头由5'磷酸化的寡核苷酸长链和与其互补的5'磷酸化的寡核苷酸短链组成，其中，所述寡核苷酸长链的5'端第一个碱基为A碱基，第二个碱基为U碱基；且其中，得到的所述带有环化接头的靶DNA片段具有以反向末端重复的形式存在于该靶DNA片段两末端的AU::TA二核苷酸对；ii应用尿嘧啶特异性切除试剂，处理由步骤i得到的所述带有环化接头的靶DNA片段，以产生两端均含有3'AT粘性末端的DNA片段；iii采用限制性内切酶处理由步骤ii产生的DNA片段，以产生经酶切的DNA片段，其中所述限制性内切酶能识别双链DNA并产生3’AT粘性末端；iv在允许由步骤iii产生的经酶切的DNA片段环化的条件下，温育所述DNA片段，以获得环化的DNA分子，其中，所述环化接头，按照所述寡核苷酸长链的5'至3'方向，具有如下结构：粘性末端生成区-辅助序列区-内部连接区，其中，粘性末端生成区由寡核苷酸长链5'最末端的AU二核苷酸组成，或由该二核苷酸和所述寡核苷酸短链上与其反向互补的二核苷酸AT组成，其中，内部连接区为用于所述环化接头与靶核酸连接的10-30bp的双链或至少部分双链寡核苷酸，其中，辅助序列区为0bp，或为10-75bp的单链或双链或部分双链的寡核苷酸，且其中，所述环化接头，按照寡核苷酸长链的5'至3'方向，为具有5'突出端和3'平末端的双链寡核苷酸，其中所述粘性末端生成区由寡核苷酸长链5'最末端的AU二核苷酸组成，且所述内部连接区由转座元件的双链寡核苷酸组成，或其中，所述环化接头，按照寡核苷酸长链的5'至3'方向，为具有5'平末端和3'突出端的双链寡核苷酸，所述粘性末端生成区由寡核苷酸长链5'最末端的AU二核苷酸和所述寡核苷酸短链上与其反向互补的二核苷酸AT组成，且所述内部连接区包含单碱基3'T突出端。

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