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申请/专利权人：上海市胸科医院
摘要：本发明公开了一种基于集成式脂质体反应器高效检测血浆细胞外囊泡miRNA的方法及应用。本发明利用免疫磁珠从血浆中捕获和富集EVs，将分离出的EVs直接与含有锁环探针、T4DNA连接酶、dNTPs、phi29聚合酶、Cas12a‑crRNA、F‑BHQ的脂质体融合，在miRNA标志物原位识别与常温指数滚环扩增后，通过Cas12a顺反两种酶切反应，实现miRNA的超灵敏检测分析。该方法可根据目标miRNA序列，设计不同的锁环探针，实现多种miRNA的集成式联合检测分析。本发明方法简化了反应程序，灵敏度高、准确性好、通量高，可用于临床血浆样本中早期肿瘤标志物的识别和检测，具有良好的应用前景。
主权项：1.一种基于集成式脂质体反应器高效检测血浆细胞外囊泡miRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：从血浆样本中获得EVs；步骤2：脂质体反应器的制备，其具体包括：步骤2.1：以脂类物质和阳离子表面活性剂为原料制备脂质体悬浮液；步骤2.2：将Cas12a、crRNA、反应缓冲液和DEPC水混合后进行孵育，制备得到Cas12a-crRNA溶液；步骤2.3：将锁环探针、T4DNA连接酶、phi29聚合酶、dNTPs、BSA、步骤2.2所得的Cas12a-crRNA溶液、寡核苷酸信号DNA、反应缓冲液和DEPC水混合，得到探针溶液；所述寡核苷酸信号DNA为修饰有荧光基团和淬灭基团的寡核苷酸分子；步骤2.4：将步骤2.1制备所得的脂质体悬浮液在PBS缓冲液中稀释后与步骤2.3所得的探针溶液等体积混合，并进行搅拌，实现探针的封装；然后通过聚碳酸酯过滤器共挤出得到装载探针的阳离子脂质体，即脂质体反应器；步骤3：将步骤1富集得到的EVs与步骤2制备得到脂质体反应器混合反应，将反应所得溶液进行荧光强度的检测，根据荧光强度响应信号值定性或定量检测出血浆细胞外囊泡中的miRNA。
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百度查询： 上海市胸科医院 基于集成式脂质体反应器高效检测血浆细胞外囊泡miRNA的方法及应用
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