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申请/专利权人：上海沂利泓生物科技有限公司;新疆沂利泓生物新材料科技有限公司

摘要：本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种重组菌株的构建和利用菌株生产衣康酸的方法，通过对天然的顺乌头酸脱羧酶基因cadA进行定点突变，将316位和428位氨基酸进行突变，得到突变的顺乌头酸脱羧酶，然后将其转入大肠杆菌表达宿主中进行异源表达，采用全细胞催化技术生产衣康酸，其产衣康酸的能力在pH5.5条件下提高了58.42％，效果显著。与天然的顺乌头酸脱羧酶相比，本发明突变后的顺乌头酸脱羧酶的催化活性更高；本发明的突变方法流程简单，所需时间短、成本低，成功率高，适合大规模推广应用，市场前景广阔。

主权项：1.一种重组菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：1设计引物，通过对顺乌头酸脱羧酶基因cadA的半理性设计，针对要突变的位点，设计引物Cad-R316T-FR和Cad-K428A-FR；所述引物Cad-R316T-FR的核苷酸序列如下所示：Cad-R316T-F：5＇-GCTATCCGGAACTGCTGAACACCGCGAACCTGAGCAAC-3＇，Cad-R316T-R：5＇-GTTCAGCAGTTCCGGATAGC-3＇；所述引物Cad-K428A-FR的核苷酸序列如下所示：Cad-K428A-F：5＇-CATTACCGAAAGCGTGGAAGCACCGCTGGGCGTGAAAG-3＇，Cad-K428A-R：5＇-TTCCACGCTTTCGGTAATGCT-3＇；2构建重组质粒以pET24a+-cadA为第一轮PCR模板，以Cad-R316T-FR为引物进行PCR扩增，将316位的精氨酸突变成苏氨酸，得到PCR产物重组质粒pET24a+-R316TcadA；第二轮PCR以第一轮PCR得到的质粒pET24a+-R316TcadA为模板，以Cad-K428A-FR为引物进行PCR扩增，将428位的赖氨酸突变成丙氨酸，得到PCR产物重组质粒pET24a+-R316TK428AcadA；3构建重组菌株将构建的重组质粒pET24a+-R316TK428AcadA转化到大肠杆菌BL21DE3感受态细胞中；经培养得到重组菌株BL21DE3pET24a+-R316TK428AcadA。

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