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申请/专利权人：河南省科学院生物研究所有限责任公司

摘要：本发明一种用于筛选产裂解多糖单加氧酶菌株酶活力的快速定量检测方法，有效解产决裂解多糖单加氧酶菌株筛选过程中检测裂解多糖单加氧酶酶活力的技术难度高、成本高的问题，以二硝基水杨酸和还原糖在碱性环境中的氧化‑还原反应为基础，在540nm波长下的吸光值，分别测定纤维素酶、LPMO和纤维素酶作用底物微晶纤维素后还原糖的含量，通过还原糖的提高量进行比较，计算LPMO的活性，能快速定量检测产裂解多糖单加氧酶菌株活性，方法简单易操作，成本低，速度快，结果稳定准确、可靠，达到快速筛选产裂解多糖单加氧酶菌株的目的，易于推广和普及，经济和社会效益显著。

主权项：1.一种用于筛选产裂解多糖单加氧酶菌株酶活力的快速定量检测方法，以二硝基水杨酸和还原糖在碱性环境中的氧化-还原反应为基础，在540nm波长下的吸光值，分别测定纤维素酶、LPMO和和纤维素酶作用底物微晶纤维素后还原糖的含量，通过还原糖的提高量进行比较，来计算LPMO的活性，具体步骤如下：A、制作标准曲线：吸取2mM的葡萄糖标准溶液0μL、50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL和500μL作体系，然后在体系的各溶液中分别加0.1molLpH6.0磷酸缓冲液到500μL配成浓度0-2.0mM的葡萄糖溶液，再分别加入500μL的3,5-二硝基水杨酸显色液沸水浴5min，冷却至室温，于540nm处测吸光值绘制成葡萄糖标准曲线；所述的3,5-二硝基水杨酸显色液是：酒石酸钾钠182.0g溶于蒸馏水800mL中，加热，趁热加入3,5-二硝基水杨酸6.30g、氢氧化钠20.96g、苯酚5.0g和亚硫酸钠5.0g，搅拌溶解均匀，冷却至室温，加蒸馏水定容至1000mL，储存在棕色瓶中；所述的2mM葡萄糖标准溶液是：取0.36ｇ葡萄糖溶于1000mL的0.1molLpH6.0磷酸缓冲液中；所述的0.1molLpH6.0磷酸缓冲液是：分别称取一水磷酸二氢钠12.1g和二水磷酸氢二钠2.189g置于容器中，用蒸馏水定容至1000mL混匀，调节溶液pH到6.0；B、制备裂解多糖单加氧酶酶液：无菌操作，将筛选分离得到的单菌株接种到3mL的YPD培养基中，37℃、180rmin摇床振荡培养发酵48h，得发酵液，将发酵液于12000rmin离心1min取上清液，即为裂解多糖单加氧酶酶液；所述的裂解多糖单加氧酶酶液为组成型裂解多糖单加氧酶酶液和诱导型裂解多糖单加氧酶酶液；所述的YPD培养基是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g溶于1000mL蒸馏水中，115Ｃ灭菌15min；C、裂解多糖单加氧酶酶活力的定量检测：制备试验样品，测出还原糖含量：取1.5mL离心管3支，编号后每管内加入200μL酸性纤维素酶标准样品和100μL裂解多糖单加氧酶酶液，与200μL的1%微晶纤维素溶液混合，在37℃水浴30min，沸水浴5min使酶失活，放入4℃水中冷却5min，加入500μL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5min，冷却至室温，于540nm处测吸光值，取3支离心管实验结果平均值，查标准曲线，测出试验样品还原糖含量为A1；制备空白组样品，测出还原糖含量：另取取1.5mL离心管3支，编号后每管内加入200μL酸性纤维素酶标准样品和100μL蒸馏水，与200μL的1%微晶纤维素溶液混合，在37℃水浴30min，沸水浴5min使酶失活，放入4℃水中冷却5min，加入500μL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5min，冷却至室温后于540nm出测吸光值，取3支离心管实验结果平均值，查标准曲线测出空白组样品还原糖含量为A2；所述的酸性纤维素酶标准样品的CAS号为：9012-54-8，10000UmL；所述的1%微晶纤维素溶液是，取1.0ｇ微晶纤维素溶于100mL0.1molLpH6.0磷酸缓冲液中，微晶纤维素的CAS号为：9004-34-6，纯度99%D、活力测定：裂解多糖单加氧酶酶活力定义：在37℃水浴30min，沸水浴5min使酶失活，放入4℃水中冷却5min，加入500μL的3,5-二硝基水杨酸显色液，沸水浴5min，冷却至室温后于540nm出测吸光值，取3支离心管实验结果平均值，1h内生成ｌμmoL还原糖定义为一个酶活力单位U；样品试验查标准曲线得到的还原糖含量A1减去空白试验查标准曲线得到的还原糖含量A2，计算得出裂解多糖单加氧酶酶活力，实现快速定量检测裂解多糖单加氧酶的酶活力。

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